3.2.1. Ảnh hưởng của thành phần cơ chất môi trường rắn đến sinh trưởng của A.oryzae T6
Sau quá trình tuyển chọn để có lượng giống dùng cho sản xuất được tiến hành nhân giống nấm mốc tuyển chọn được. Trong quá trình nhân giống cần lựa chọn môi trường, vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trinh sinh trưởng của vi sinh vật. Thành phần môi trường phải đáp ứng đầy đủ các dinh dưỡng và sự phát triển hiếu khí của chủng nấm mốc A.oryzae.
Nghiên cứu tiến hành nhân giống nấm mốc A.oryzae T6 tuyển chọn được trên các môi trường khác nhau để kiểm tra khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng (mục 2.3.1). Nhằm tìm ra được cơ chất môi trường phù hợp cho nhân giống A.oryzae T6 đạt hiệu quả cao từ các cơ chất nguyên liệu phổ biến là bột ngô, bột đỗ tương, cám gạo và gạo.
Thành phần cơ chất phù hợp cho quá trình nhân giống nhân giống A.oryzae T6 cho phát triển mật độ tế bào cao được chọn làm thông số cho nhân giống A.oryzae T6.
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng nhân giống được trình bày (Hình 3.3) cho thấy A.oryzae T6 có thể phát triển trên tất cả các môi trường khảo sát, tuy nhiên do thành phần dinh dưỡng của môi trường khác nhau nên mật độ tế bào của A.oryzae T6 thay đổi từ 31 × 106 đến 68 × 106 CFU/g, đáng chú ý là trên môi trường M5 (thành phần (g/g) gồm cám gạo : gạo : trấu = 2 : 2 : 1; độ ẩm 50%) mật độ tế bào đạt cao nhất 68 × 106 CFU/g.
Hình 3.3 Ảnh hưởng của thành phần cơ chất môi trường rắn đến mật độ tế bào của A.oryzae T6 Ghi chú:
- M1 có tỷ lệ: Bột ngô : trấu là 4 : 1 - M2 có tỷ lệ: Đỗ tương : trấu là 4 : 1 - M3 có tỷ lệ: Cám gạo : trấu là 4 : 1 - M4 có tỷ lệ: Gạo : trấu là 4 : 1
- M5 có tỷ lệ: Cám gạo : gạo : trấu là 2 : 2 : 1 Các môi trường này đều có độ ẩm 50% và pH 5,5.
Vì vậy, lựa chọn môi trường M5 làm môi trường nhân giống A.oryzae T6. Kết quả cũng tương đồng với một số nghiên cứu chỉ ra gạo và cám gạo là môi trường thuận lợi cho sự phát triển của nhiều loại nấm mốc như A.oryzae, A.awamorrii, A.Kawachi… [18, 47, 94]
Kết quả tổng hợp ở Hình 3.3 cũng góp phần khẳng định tầm quan trọng của thành phần cơ chất đến quá trình sinh trưởng của A.oryzae T6. Ở tỷ lệ phối trộn giữa cám gạo và gạo là 2 : 2 , mật độ tế bào của A.oryzae T6 trong cám gạo và gạo là nguồn cơ chất thích hợp nhất cho A.oryzae T6 phát triển. Bên cạnh các thành phần dưỡng chất như khoáng, nguồn nitrogen... của cơ chất thì độ thoáng khí cũng có tác động tích cực đến quá trình tăng trưởng, phát triển của nấm mốc [6, 8]. Trong môi trường nhân giống có thành phần
trấu để tăng độ xốp của môi trường đảm bảo lượng oxy cần thiết cho nấm mốc sinh trưởng, thành phần này cần được khảo sát với từng trường hợp cụ thể.
3.2.2. Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ trấu trong môi trường rắn đến sinh trưởng của A.oryzae T6
A.oryzae là loài hô hấp hiếu khí vì vậy việc cung cấp oxy đầy đủ trong quá trình sinh trưởng và phát triển là yêu cầu quan trọng và cần thiết [6]. Do đó trong quá trình nhân giống bổ sung thêm trấu để tăng độ xốp của môi trường đảm bảo lượng oxy cần thiết cho nấm mốc sinh trưởng.
Hình 3.4 Ảnh hưởng của thành phần tỷ lệ trấu trong môi trường rắn đến mật độ tế bào của A.oryzae T6 Tuy nhiên yêu cầu đặt ra tỷ lệ trấu phối trộn bao nhiêu để có thể đảm bảo lượng oxy, độ xốp môi trường nhưng vẫn đảm bảo được nguồn dinh dưỡng cho quá trình sinh trưởng bình thường của chủng. Vì vậy, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ trấu phối trộn đến sinh trưởng của A.oryzae T6 theo phương pháp đã trình bày (mục 2.2.3.2) nhằm tìm ra được tỷ lệ trấu phù hợp trong môi trường cho nhân giống A.oryzae T6 đạt hiệu quả cao làm thông số cho nhân giống A.oryzae T6.
Kết quả nghiên cứu cho thấy (Hình 3.4), ở các tỷ lệ trấu khác nhau sự phát triển của nấm mốc khác nhau, ở tỷ lệ trấu từ 5 - 20%, sự phát triển của chủng tăng nhanh từ 41 x 106 CFU/g đến 66 × 106 CFU/g. Khi tỷ lệ trấu tăng trên 20% (25 - 40%) thì khả năng sinh trưởng của nấm mốc giảm xuống rõ rệt từ 64 × 106 CFU/gxuống 36 × 106 CFU/g.
Hình 3.4 còn cho thấy tỷ lệ trấu trong môi trường nhân giống từ 15% đến 30 % là thích hợp cho sự phát triển của chủng, trong khoảng này mật độ tế bào cũng rất khác nhau:
Tỷ lệ trấu 15% cho mật độ tế bào đạt 54 x 106 CFU/g, tỷ lệ trấu 25% cho mật độ tế bào đạt 64 × 106 CFU/g, tỷ lệ trấu 30% cho mật độ tế bào đạt 61 × 106 CFU/g và tỷ lệ trấu 20%
mật độ tế bào cao nhất đạt 66 x 106 CFU/g. Vì vậy, bên cạnh nguồn dinh dưỡng như nguồn carbon, khoáng chất... thành phần môi trường tạo được độ thoáng khí là một trong các điều kiện thiết yếu cho quá trình sinh trưởng của vi sinh vật, đặc biệt là nấm mốc.
Tóm lại tỷ lệ trấu 20 % trong môi trường rắn có thành phần cám gạo và gạo (tỷ lệ 1:1), cho mật độ tế bào cao nhất trong nhân giống A.oryzae T6 đạt 66 x 106 CFU/g sau 72 giờ nuôi ở nhiệt độ 30 ± 20C.
3.2.3. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6
Độ ẩm bên trong môi trường nhân giống nấm có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh trưởng phát triển của nấm mốc. Độ ẩm thấp thường sẽ kìm hãm sự phát triển, còn độ ẩm cao quá sẽ làm giảm độ thoáng khí, ảnh hưởng tới sinh trưởng phát triển của vi sinh vật [6].
Để xác định ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng sinh trưởng của chủng nấn mốc A.oryzae T6 trên môi trường rắn, ở nghiên cứu này tiến hành khảo sát độ ẩm môi trường nhân giống trong khoảng 45 – 70% theo phương pháp đã trình bày (mục 2.2.3.3) nhằm tìm được độ ẩm phù hợp trong môi trường nhân giống A.oryzae T6 cho phát triển mật độ tế bào cao.
Hình 3.5 cho thấy độ ẩm môi trường rắn ảnh hưởng tới tốc độ phát triển của A.oryzae T6, ở độ ẩm 45% và 70% cho thấy A.oryzae T6 phát triển với mật độ tế bào ít hơn nhiều so với ở các độ ẩm khác được khảo sát, trong khi độ ẩm ở 55% cho thấy A.oryzae T6 phát triển với mật độ tế bào lớn hơn cả (65×107 CFU/g). Vì vậy, bên cạnh nguồn dinh dưỡng như nguồn carbon, khoáng chất, độ thoáng khí của môi trường rắn...
độ ẩm môi trường là một trong các điều kiện thiết yếu cho quá trình sinh trưởng của vi sinh vật, đặc biệt là nấm mốc.
Hình 3.5 Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của môi trường nhân giống đến mật độ tế bào của A.oryzae T6 Vì vậy độ ẩm 55% ban đầu ở môi trường rắn nhân giống cho mật độ tế bào cao nhất trong nhân giống A.oryzae T6 đạt 65x107 CFU/g sau 120 giờ nuôi ở nhiệt độ 30 ± 20C.
3.2.4. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6
pH là yếu tố quan trọng trong quá trình sinh trưởng của nấm mốc, pH thích hợp sẽ thuận lợi cho nấm mốc phát triển, thực nghiệm tiến hành nghiên cứu khảo sát pH thích hợp cho nấm mốc A.oryzae T6 phát triển từ là từ pH 3,5 đến pH 7,0 theo phương pháp đã trình bày (mục 2.2.3.4) nhằm tìm được pH phù hợp trong môi trường cho nhân giống A.oryzae T6 cho phát triển mật độ tế bào cao được chọn làm thông số cho nhân giống A.oryzae T6.
Kết quả thu được (Hình 3.6) cho thấy pH môi trường có ảnh hưởng đến sinh trưởng của A.oryzae T6, ở pH 4,5 - 6,0 cho mật độ tế bào A.oryzae T6 lớn, tuy nhiên ở điểm pH 5,5 tốc độ phát triển của A.oryzae T6 lớn nhất, mật độ tế bào đạt 68×106 CFU/g. Điều này cũng phù hợp với các nghiên cứu của Shie-Jea Lin và cộng sự (2010) [149]. Vì vậy, pH 5,5 ban đầu của môi trường nhân giống cho A.oryzae T6 sinh trưởng đạt mật độ tế bào lớn nhất, đạt 67x106 CFU/g sau 72 giờ, ở nhiệt độ 30 ± 20C.
Hình 3.6 Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nhân giống đến mật độ tế bào của A.oryzae T6 3.2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6
Nhiệt độ là một trong yếu tố đóng vai trò chủ yếu trong sự sinh trưởng của sợi nấm và tác động đến việc sản sinh bào tử cũng như sự nảy mầm của chúng. Nhiệt độ phát triển của đa số nấm mốc là 25 - 35oC. Nếu nhiệt độ xuống dưới 24oC nấm mốc phát triển chậm, sinh bào tử yếu, thời gian nuôi cấy kéo dài, khoảng nhiệt độ để nấm mốc phát triển rộng từ (2 - 500C). Tuy nhiên để biết nhiệt độ phù hợp cho A.oryzae T6 sinh trưởng, ở thực nghiệm này tiến hành nuôi A.oryzae T6 ở nhiệt độ khác nhau từ 20 - 400C theo phương pháp đã trình bày (mục 2.2.3.5 ), xác định được nhiệt độ phù hợp cho nhân giống A.oryzae T6 cho phát triển mật độ tế bào cao được chọn làm thông số cho nhân giống A.oryzae T6.
Kết quả thu được (Hình 3.7) cho thấy ở nhiệt độ 200C và 400C A.oryzae T6 phát triển với mật độ tế bào thấp tương ứng là 41x106 CFU/g và 51x106 CFU/g. Ở nhiệt độ 300C mật độ tế bào của A.oryzae T6 cao nhất đạt 69×106 CFU/g. Điều này có thể do nhiệt độ cao đã kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển của nấm và làm giảm khả năng tạo bào tử nấm.
Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ nhân giống đến mật độ tế bào của A.oryzae T6
Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu của Shie-Jea Lin và cộng sự (2010) công bố với nhiệt độ 300C là thích hợp cho A.oryzae LL1 và LL2 phất triển mạnh [149]. Vì vậy, nhiệt độ nuôi nhân giống A.oryzae T6 ở nhiệt độ 30 ± 20C cho sinh trưởng đạt mật độ tế bào lớn nhất, đạt 69x106 CFU/g sau 72 giờ nuôi nhân giống.
3.2.6. Ảnh hưởng của độ dày khối môi trường nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6
A.oryzae là hô hấp hiếu khí vì vậy việc cung cấp oxy đầy đủ trong quá trình sinh trưởng và phát triển là yêu cầu quan trọng và cần thiết. Lượng oxy cung cấp tỷ lệ với độ dày của khối môi trường nhân giống. Nếu nuôi A.oryzae với độ dày khối môi trường quá lớn thí khối ủ sẽ thiếu sự tiếp xúc với không khí, làm mốc phát triển cục bộ ở bề mặt ngoài của khối ủ, do đó lượng bào tử mốc tạo thành sẽ giảm.
Hình 3.8 Ảnh hưởng của độ dày khối môi trường nhân giống đến mật độ tế bào của A.oryzae T6 (a,b,c,d,e,f thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa giữa các công thức ở mức ý nghĩa α = 0,05) Thực nghiệm tiến hành khảo sát ảnh hưởng của độ dày khối môi trường đến khả năng sinh trưởng của A.oryzae T6 theo phương pháp đã trình bày (mục 2.2.3.5 ), các môi trường M5 nuôi ở các độ dày khối môi trường khác nhau: 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 và 9,0 cm. Sau 120 giờ nuôi ở nhiệt độ 30 ± 20C, xác định mật độ tế bào A.oryzae T6 (mục 2.2.1), xác định được tỷ lệ độ dày khối môi trường phù hợp cho nhân giống A.oryzae T6 cho phát triển mật độ tế bào cao được chọn làm thông số cho nhân giống A.oryzae T6.
Hình 3.8 cho thấy, kết quả độ dày khối môi trường khác nhau cho khả năng sinh trưởng của nấm mốc khác nhau, mật độ tế bào phất triển dao động từ 44 x 107 đến 67 ×107 CFU/g, ở độ dày khối môi trường 6 cm cho sinh trưởng của A.oryzae T6 có mật độ tế bào đạt lớn nhất là 67 × 107 CFU/g. Mẫu có độ dày khối môi trường mỏng ( 2, 3 và 4 cm), khối môi trường dần bị khô và sợi mốc phát triển yếu hơn, do lớp cơ chất nuôi quá mỏng dẫn tới thiếu ẩm, với các mẫu có độ dày khối môi trường 7 cm, 8 cm và 9 cm, hệ sợi phát triển yếu dần và số lượng bào tử ít hơn so với mẫu 6 cm và chủ yếu chỉ mọc trên bề mặt khối môi trường.
Do vậy ở nghiên cứu này, lựa chọn độ dày khối môi trường của khối ủ để tạo bào tử thích hợp nhất là 6 cm... Vì vậy, bên cạnh nguồn dinh dưỡng như nguồn carbon, khoáng
chất, độ ẩm, pH... độ dày khối môi trường tạo được độ thoáng khí là một trong các điều kiện thiết yếu cho quá trình sinh trưởng của vi sinh vật, đặc biệt là nấm mốc.
Tóm lại độ dày khối môi trường rắn ảnh hưởng tới khả năng phát sinh sinh trưởng của A.oryzae T6, độ dày khối môi trường 6 cm cho mật độ tế bào cao nhất trong nhân giống A.oryzae T6 đạt 67x107 CFU/g sau 120 giờ nuôi ở nhiệt độ 30 ± 20C.
3.2.7. Ảnh hưởng của thời gian nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6
Thời gian là nhân tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của chủng nấm mốc. Thời gian quá dài hoặc quá ngắn đều ảnh hưởng đến lượng tế bào tạo thành. Thời gian nuôi cấy nếu kết thúc sớm thì sản lượng mốc chưa đạt tối đa, nếu kết thúc muộn thì sẽ ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm cũng như làm tăng chi phí sản xuất.
Hình 3.9 Ảnh hưởng của thời gian nhân giống đến mật độ tế bào của A.oryzae T6
Để xác định thời gian nhân A.oryzae T6 thích hợp cho quá trình phát triển của A.oryzae T6. Sau khi biết được một số thông số kỹ thuật nhân giống đến sinh trưởng của A.oryzae T6, thực nghiệm tiến hành khảo sát ở khoảng thời gian nhân giống khác nhau theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.2.3.7, xác định được thời gian phù hợp cho nhân giống A.oryzae T6 cho phát triển mật độ tế bào cao được chọn làm thông số cho nhân giống A.oryzae T6.
Hình 3.9 cho thấy kết quả ở thời gian nhân giống khác nhau, A.oryzae T6 có mật độ tế bào khác nhau, dao động 44 x 107 đến 67 x 107 CFU/g với thời gian từ 2 – 9 ngày. Ở thời gian nhân giống 5 ngày 6 ngày và 7 ngày cho mật độ tế bào A.oryzae T6 đạt cao nhất là 67x107 CFU/g đến 68×107 CFU/g.
Vì vậy, thời gian 5 ngày nhân giống là phù hợp cho sinh trưởng cho mật độ tế bào cao trong nhân giống A.oryzae T6 đạt 67x107 CFU/g, ở môi trường rắn có tỷ lệ khối lượng cám gạo : gạo : trấu tương ứng là 2 : 2 : 1; độ ẩm là 55%; pH là 5,5; ở độ dày khối môi trường là 6 cm, tỷ lệ tiếp giống ban đầu là 105 CFU/g và nhân giống ở nhiệt độ 30 ± 20C. Kết quả cho thấy cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thu Vân, 2009 là lượng mật độ tế bào của nấm mốc đạt cao sau 5 ngày nuôi cấy [18].