3.4. Chiết xuất AGIs từ đỗ đen xanh lòng lên men bằng A.oryzae T6 (đỗ đen lên men) bằng sử dụng sóng siêu âm
3.4.5. Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến khả năng chiết xuất
Thường các hoạt chất trong nguyên liệu chiết xuất có hàm lượng phân tử nhỏ hơn một số tạp chất nguyên liệu nên quá trình khuếch tán nhanh chóng đạt đến cân bằng. Nếu kéo dài thời gian chiết, tỷ lệ hoạt chất trong dịch chiết không tăng, nhưng sẽ tăng tỷ lệ tạp chất khuếch tán vào trong dịch chiết. Do đó, thời gian chiết có ảnh hưởng rất lớn tới chất lượng dịch chiết và hiệu suất chiết xuất. Thời gian chiết xuất càng dài thì càng chiết xuất kiệt hoạt chất có trong nguyên liệu. Tuy nhiên, đến một thời gian chiết xuất nhất định thì lượng hoạt chất tăng lên rất chậm hoặc không tăng nữa. Đánh giá khả năng chiết xuất ở các thời gian và cường độ siêu âm khác nhau: 0 (không siêu âm), 1, 2, 4, 6 và 8 W/cm2, thời gian siêu âm chiết xuất là 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 và 20 phút theo phương pháp đã được trình bày (mục 2.3.5.5). Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của dung dịch chiết và hoạt lực kìm hãm α-glucosidase của chất khô hòa tan (IC50) trong dịch chiết ở từng mốc thời gian của cường độ siêu âm tương ứng với từng thí nghiệm, từ đó xác định được hiệu quả chiết xuất AGIs theo cường độ siêu âm và thời gian chiết xuất, từ đó xác định được thời gian chiết xuất, cường độ siêu âm phù hợp cho chiết xuất AGIs đạt hiệu quả cao.
Kết quả trình bày (Hình 3.23) cho thấy, chiết xuất không sử dụng sóng siêu âm (đối chứng), khi điều chỉnh với thời gian chiết xuất theo thứ tự 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 và 20 phút cho dịch chiết có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase lần lượt tương ứng 52,73±0,41; 53,41±0,46; 53,75 ± 0,34; 54,85 ± 0,50; 57,02 ± 0,48; 58,54 ± 0,43; 59,82 ± 0,46; 61,25 ± 0,43; 62,38 ± 0,68; 62,71 ± 0,51 và 62,89 ± 0,55 %, IC50 (hoạt lực kìm hãm α-glucosidase) của chất hòa tan trong dịch chiết lần lượt tương ứng 781,12 ± 6,68; 695,61
± 6,21; 673,21 ± 5,26; 655,69 ± 6,62; 634,38 ± 6,65; 608,18 ± 5,69; 583,25 ± 5,53; 567,08
± 7,06; 538,37 ± 5,37; 516,1 ± 6,07 và 498,31 ± 6,89 μg/ml.
Chiết xuất sử dựng sóng siêu âm 20 kHZ, khi điều chỉnh với thời gian chiết xuất theo thứ tự 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 và 20 phút, ở cường độ siêu âm:
- Cường độ sóng siêu âm 1 w / cm2 cho dịch chiết có hoạt tính kìm hãm α- glucosidase tăng lần lượt tương ứng là 50,38 ± 0,32; 54,78 ± 031; 67,07 ± 0,49; 68,25 ± 0,51; 69,10 ± 0,35; 69,04 ± 0,49; 69,85 ± 0,71; 71,01 ± 0,68; 72,41 ± 0,67 và 73,21 ± 0,74%, IC50 của chất hòa tan trong dịch chiết mạnh lên lần lượt tương ứng là 661,62 ± 3,06; 586,71 ± 3,27; 545,27 ± 5,48; 511,57 ± 4,65; 472,24 ± 3,02, 432,03 ± 4,32; 417,38 ± 6,25; 388,21 ± 5,39; 356,07 ± 6,48 và 344,02 ± 6,82 μg/ml.
Hình 3.23 Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến hoạt tính kìm hãm α- glucosidase (%) và IC50 của dịch chiết đỗ đen lên men
- Cường độ sóng siêu âm 2 w / cm2 cho dịch chiết có hoạt tính kìm hãm α- glucosidase tăng lần lượt tương ứng là 62,90 ± 0,42; 66,50 ± 0,46; 69,01 ± 0,81; 70,57 ± 0,45; 72,12 ± 0,53; 73,69 ± 0,64; 74,02 ± 0,61; 75,34 ± 0,73; 76,41 ± 0,72 và 76,73 ± 0,97
%, IC50 của chất hòa tan trong dịch chiết mạnh lên lần lượt tương ứng là 602,12 ± 5,02;
518,14 ± 4,72; 483,31 ± 7,95; 442,46 ± 4,08; 412,25 ± 4,26; 387,21 ± 5,01; 354,42 ± 4,27;
338,18 ± 5,05; 322,26 ± 5,04 và 314,05 ± 7,16 μg/ml.
- Cường độ sóng siêu âm 4 w / cm2 cho dịch chiết có hoạt tính kìm hãm α- glucosidase tăng lần lượt tương ứng là 64,53 ± 0,58; 69,19 ± 0,47; 71,83 ± 0,44; 73,91 ± 0,64; 76,09 ± 0,57; 78,18 ± 0,75; 79,07 ± 0,63; 79,67 ± 0,82; 80,17 ± 0,76 và 80,75 ± 1,01%, IC50 của chất hòa tan trong dịch chiết mạnh lên lần lượt tương ứng là 519,21 ± 6,21; 443,24 ± 4,25; 411,05 ± 3,78; 383,28 ± 4,84; 352,31 ± 4,06; 336,61 ± 5,13; 317,58 ± 4,08; 303,29 ± 5,25; 291,41 ± 4,57 và 286,39 ± 6,38 μg/ml.
- Cường độ siêu âm 6 W/cm2 với thời gian siêu âm chiết xuất 2, 4, 6, 8, 10, 12 và 14 phút, hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ở dịch chiết tăng tương ứng là 70,24 ± 0,61;
74,64 ± 0,83; 78,53 ± 0,65; 80,41 ± 0,53; 82,06 ± 0,67; 83,85 ± 1,02 và 84,11 ± 0,92 %, hoạt lực kìm hãm α-glucosidase mạnh lên tương ứng, IC50 là 421,23 ± 5,36; 361,31 ± 6,12; 326,06 ± 4,25; 301,22 ± 3,21; 276,18 ± 3,78; 258,53 ± 4,81 và 248,26 ± 4,65 àg/ml, sau 16, 18 và 20 phút siêu âm chiết xuất cho thấy hoạt tính kìm hãm α-glucosidase vẫn tăng, tương ứng là 84,62 ± 0,96; 85,91 ± 1,03 và 86,27 ± 1,21%, nhưng hoạt lực kìm hãm α-glucosidase giảm có IC50 tương ứng là 241,03 ± 4,82; 258,74 ± 6,19 và 271,15 ± 6,72 μg/ml ở 3 mức thời gian này cho thấy hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ở dịch chiết xuất chênh lệch không nhiều so với mức thời gian 14 phút và cho hoạt lực kìm hãm α- glucosidase có IC50 lại yếu dần.
- Cường độ siêu âm 8 W/cm2 với thời gian siêu âm chiết xuất 0, 2, 4, 6, 8 và 10 phút, hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ở dịch chiết tăng tương ứng là 52,73 ± 0,41; 77,22
± 1,24; 80,87 ± 1,20; 84,62 ± 1,21; 87,67 ± 1,18 và 89,85 ± 0,97 %, hoạt lực kìm hãm α- glucosidase mạnh lên tương ứng, IC50 là 781,12 ± 6,58; 335,03 ± 8,12; 300,51 ± 7,21;
261,04 ± 6,24; 242,47 ± 5,73 và 230,0 ± 4,47àg/ml, sau 12, 14, 16, 18 và 20 phỳt siờu âm chiết xuất cho thấy hoạt tính kìm hãm α-glucosidase vẫn tăng, tương ứng là 90,33 ± 0,81; 91,42 ± 0,72; 92,01 ± 0,77; 93,03 ± 0,42 và 94,05 ± 0,69%, nhưng hoạt lực kìm hãm α-glucosidase giảm có IC50 tương ứng là 247,21 ± 4,46; 268,38 ± 3,87; 290,28 ± 4,49; 342,19 ± 3,03 và 383,21 ± 5,26 àg/ml, ở 5 mức thời gian này cho thấy hoạt tớnh kìm hãm α-glucosidase ở dịch chiết chênh lệch không nhiều so với mức thời gian 10 phút
và cho hoạt lực kìm hãm α-glucosidase có IC50 lại yếu dần, trong khi đó ở cường độ 6 W/cm2 hoạt tính kìm hãm α-glucosidase tăng theo thời gian chiết xuất và IC50 mạnh nhất ở mức thời gian 16 phút, sau 18 phút siêu âm chiết xuất cho hoạt lực kìm hãm α- glucosidase của chất khô hòa trong dung môi chiết xuất có IC50 yếu dần.
Phân tích các kết quả (Hình 3.23) cho thấy các mốc thời gian ở các cường độ siêu âm được khảo sát là khi cường độ và thời gian siêu âm tăng thì càng cho khả năng chiết xuất AGIs tăng cao, cao hơn hiều so với đối chứng (không sử dụng sóng siêu âm, cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ở dịch chiết là thấp nhất), kết quả ở các mức cùng thời gian chiết xuất cho thấy khả năng chiết xuất AGIs cao nhất ở cường độ siêu âm là 8 W/cm2, như cùng thời gian siêu âm chiết xuất 10 phút ở cường độ siêu âm 0, 1, 2, 4, 6 và 8 W/cm2 cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ở dịch chiết lần lượt là 58,54 ± 0,43; 69,10 ± 0,35; 72,12 ± 0,53; 76,09 ± 0,57; 82,06 ± 0,67 và 89,85 ± 0,97 %; hoạt lực kìm hãm α-glucosidase có IC50 mạnh dần tương ứng là 608,18 ± 5,69; 472,24 ± 3,02; 412,25 ± 4,26; 352,31 ± 4,06;
276,18 ± 3,78 và 320,00 ± 4,47 àg/ml. Sự tăng khả năng chiết xuất là do ở cường độ siờu âm càng cao, càng tăng hiện tượng sủi bọt tạo lực phá vỡ cao, làm tăng tốc độ truyền khối của chất chiết. Ngoài ra, sự phá vỡ bọt cũng tạo sự khuấy trộn giúp cho khuyếch tán chất chiết bên trong nguyên liệu thoát ra ngoài dễ dàng hơn [97].
Hình 3.23 cho thấy cường độ siêu âm 0, 1, 2 và 4 W/cm2 cho hoạt hoạt tính kìm hãm α-glucosidase tăng và hoạt lực kìm hãm α-glucosidase mạnh cùng thời gian siêu âm chiết xuất tăng, ở các khảo sát thời gian siêu âm chiết xuất cho hoạt tính và hoạt lực kìm hãm α- glucosidase mạnh nhất ở 20 phút siêu âm chiết xuất, ở đối chứng cho hoạt tính kìm hãm α- glucosidase là 62,89 ± 0,55% và IC50 là 498,31 ± 6,89 àg/ml, cường độ siờu õm 1 W/cm2 cho hoạt tớnh kỡm hóm α-glucosidase là 73,21 ± 0,74% và IC50 là 344,02 ± 6,82 àg/ml, cường độ siêu âm 2 W/cm2 cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase là 76,73 ± 0,97% và IC50
là 314,05 ± 7,16 àg/ml, chiết xuất ở cường độ siờu õm 4 W/cm2 cho hoạt tớnh kỡm hóm α- glucosidase 80,75 ± 1,01% và IC50 là 286,39 ± 6,38 àg/ml, tuy nhiờn ở cường độ siờu õm 6 và 8 W/cm2 hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cũng tăng cùng thời gian siêu âm chiết xuất tăng, nhưng hoạt lực kìm hãm α-glucosidase tăng ở thời gian nhất định, ở cường độ 6 W/cm2 với thời gian siêu âm chiết xuất khảo sát từ 0 – 16 phút cho hoạt tính kìm hãm α- glucosidase và hoạt lực kìm hãm α-glucosidase tăng mạnh lên, từ 17 đến 20 phút cho thấy hoạt tính kìm hãm α-glucosidase tăng, nhưng hoạt lực kìm hãm α-glucosidase lại yếu đi, hoạt lực cao nhất ở 16 phỳt siờu õm chiết xuất cho IC50 là 241,03 ± 4,82 àg/ml.
Có thể giải thích là thời gian siêu âm càng dài, cường độ càng lớn, hạt nguyên liệu chiết xuất bị phá hủy càng nhiều thì độ nhớt và độ hòa tan càng tăng, chỉ số hòa tan tăng tương ứng với tăng cường độ và thời gian siêu âm. Độ nhớt cũng tăng khi cường độ và thời gian siêu âm tăng nhưng khi cường độ đạt đên một giá trị nào đó làm độ nhớt giảm và khi số lượng các phân tử mạch ngắn nhiều hơn thì độ nhớt cũng tăng lên theo. Đi kèm với việc siêu âm là sự tăng nhiệt độ mẫu.
Cường độ siêu âm càng lớn, thời gian càng dài nhiệt độ mẫu càng cao. Do đó đây cũng là một tác nhân góp phần tăng hiệu suất quá trình chiết xuất. Cường độ siêu âm cường độ cao có thể làm giãn bong bóng quá nhanh trong suốt chu kỳ áp suất âm do đó làm cho bong bóng không có cơ hội co rút trong chu kỳ áp suất dương. Ngược lại khi cường độ siêu âm nhỏ hơn thì số lần bong bóng giãn ra và nén lại sẽ tăng lên. Do đó thời gian xử lí sẽ dài hơn [92].
Cường độ sóng siêu âm càng mạnh thì khả năng chiết xuất hoạt chất cao ở thời gian càng ngắn hơn và sau thời gian nhất định càng tăng thời gian chiết xuất càng cho khả năng chiết xuất AGIs cao, nhưng giá trị IC50 hoạt lực kìm hãm α-glucosidase chất hòa tan trong dung môi chiết xuất giảm dần. Điều này có thể ở thời gian chiết xuất kéo dài nhất định sẽ tăng các tạp chất hòa tan vào dung môi chiết xuất. Do đó, để tiết kiệm thời gian và chi phí, mức thời gian 10 phút siêu âm chiết xuất ở cường độ siêu âm 8 W/cm2 được lựa chọn phù hợp nhất cho chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men, cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao (89,85 ± 0,97%) và cú IC50 mạnh nhất (230,00 ± 4,47àg/ml).
Kết quả cũng cho thấy năng lượng sóng siêu âm đem lại hiệu quả khả năng chiết xuất AGIs, tăng cường độ sóng siêu âm, phần lớn tăng khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men.
Kết quả (Bảng 3.3) cho thấy chiết xuất bằng sóng siêu âm cường độ 8W/cm2 với tần số 20 kHz ở nhiệt độ 60 ± 1,00C trong 10 phút cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase là 89,85 ± 0,97%, IC50 là 230,00 ± 4,47 àg/ml và lượng chất khụ thu được 2,28 ± 0,042%, còn phương pháp chiết không sử dụng sóng siêu âm, chiết xuất ở nhiệt độ 60 ± 1,00C trong 10 phút cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase đạt 58,54 ± 0,84%, IC50 là 608,18 ± 5,03 àg/ml và lượng chất khụ thu được 1,49 ± 0,031%, chiết xuất khụng sử dụng súng siờu õm ở nhiệt độ 800C trong 120 phút (2 giờ) cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase đạt 78,20 ± 1,06 %, IC50 là 516,15 ± 6,21 àg/ml và lượng chất khụ thu được 5,12 ± 0,43% cho thấy chiết xuất không sử dụng sóng siêu âm đều cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase thấp hơn và hoạt lực kìm hãm α-glucosidase có IC50 đều yếu hơn so với chiết xuất ở cường độ siêu
âm 8w/ cm2 với thời gian 10 phút cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao hơn 11,65 % so với chiết xuất không có siêu âm trong 2 giờ ở nhiệt độ 800C và giảm đáng kể nhiệt độ chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men từ nhiệt độ 800C ở quá trình chiết xuất thông thường để giảm nhiệt độ chiết xuất ở nhiệt độ 600C trong quá trình sử dụng sóng siêu âm (giảm khoảng 25% nhiệt độ chiết xuất). Cho thấy năng lượng sóng siêu âm đem lại hiệu quả chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men.
Bảng 3.3 So sánh phương pháp chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men bằng sử dụng sóng siêu âm và không sử dụng sóng siêu âm
Chỉ tiêu Đơn vị
Chiết xuất AGIs sử dụng sóng siêu âm cường độ 8W/cm2 với tần số 20 kHz
Chiết xuất AGIs không sử dụng sóng siêu âm
Dung môi ethanol 50% : đỗ
đen lên men lít / kg 6 6 6
Nhiệt độ chiết xuất 0C 60 ± 1,0 60 ± 1,0 80 ± 1,0
Thời gian chiết xuất phút 10 10 120
Hoạt lực kìm hãm α-
glucosidase (IC50) àg/ml 230,00 ± 4,47 608,18 ± 5,03 516,15 ± 6,21 Lượng chất khô so với đỗ đen
lên men (%) 2,28 ± 0,042 1,49 ± 0,031 5,12 ± 0,43
Hoạt tính kìm hãm α-
glucosidase ở dịch chiết % 89,85 ± 0,97 58,54 ± 0,84 78,20 ± 1,06
Kết quả cho thấy điều kiện thích hợp chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao là: chiết xuất bằng sóng siêu âm cường 8 W/cm2 ở tần số 20 kHZ /dung tích 20 lít với tỷ lệ dung môi ethanol 50% : bột đỗ đen lên men là 6 lít / kg, ở nhiệt độ 600C sau 10 phút siêu âm cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao (89,85 ± 0,97%) và IC50 mạnh nhất (230,00 ± 4,47àg/ml).