Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp phân tích và đo đạc
2.2.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào nấm mốc [14]
Bằng phương pháp đếm gián tiếp thông qua số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường đĩa thạch: Cân 10 gam mẫu hòa với 90 ml nước cất vô trùng, đồng nhất mẫu. Hút 1 ml chuyển sang ống nghiệm thứ nhất có chứa 9 ml nước cất vô trùng. Trộn bằng máy Voltex. Lập lại lần thứ ba, thứ tư...tới nồng độ thích hợp để tách các khuẩn lạc. Hút 200 μl dung dịch đã pha loãng cho vào đĩa petri có môi trường Czapek – Dox. Trang thật đều trên bề mặt thạch. Đặt vào tủ ở nhiệt độ 300C trong 2 ngày sau đó lấy ra đếm số khuẩn lạc A.oryzae.
Cách tính số lượng vi sinh vật trong mẫu phân tích
Số lượng vi sinh vật trung bình có trong 1ml hay 1g mẫu (N) được tính theo công thức:
∑C: tổng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony forming unit (CFU)) đếm được trên tất cả các đĩa
n1: số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ nhất (độ pha loãng thấp nhất) n2: số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ hai (độ pha loãng tiếp theo) f1: hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ nhất
v: thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa petri
2.2.2. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase
2.2.2.1. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của môi trường sau lên men theo phương pháp của Yamaki và Mori (2006) [162]
10 g môi trường sau lên men bề mặt được nghiền nhỏ bằng cối sứ, bổ sung 90 g nước cất, chiết ở 1000 C trong 3 giờ. Lọc bằng ly tâm ở 3800 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch trong, xác định % hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (mục 2.2.2.3).
2.2.2.2. Xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của dịch chiết xuất bằng dung môi
Dịch chiết xuất bằng dung môi được lọc tách cặn, phần dịch lọc được ly tâm 3800 vòng / phút trong 10 phút, thu dich nổi, cô dịch nổi bằng thiết bị cô chân không (ở nhiệt độ 600C, - 0,8 atm) để loại dung môi, thu cao khô, hòa tan trở lại trong nước cất bằng lượng dịch chiết trước khi cô, đem xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (%) theo phương pháp của Toomoyuki và cộng sự, 1999 [153] (mục 2.2.2.3). Thí nghiệm tiến hành lập lại 3 lần đối với mỗi mẫu.
2.2.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase theo Toomoyuki và cộng sự, (1999) [153]
Nguyên tắc:
HO
HO O
OH
OH OH
OH
NO2 HO
HO O
OH
OH O
O2N
p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid α- D-glucose p-nitrophenol
α–glucosidase phản ứng với p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (p NPG) giải phóng 4 – nitrophenol. Hoạt tính kìm hãm α-glucosidase được đánh giá bằng cách xác định sự tạo thành 4 – nitrophenol ở bước sóng 405 nm sau khi phản ứng xúc tác của α-glucosidase với cơ chất p-Nitrophenyl α - D - glucopyranoside có tham gia của AGIs. Điều kiện phản ứng với nồng độ cơ chất 1mg/ml, thời gian phản ứng là 30 phút và lượng α - glucosidase là 50àl (nồng độ 0,2 U/ml).
I (%) = (A đối chứng – Amẫu) × 100/A đối chứng
I (%):Hoạt tính kìm hãm α-glucosidase
A đối chứng: Độ hấp thụ của mẫu phản ứng bao gồm cơ chất p NPG và α-glucosidase.
Amẫu: Độ hấp thụ của mẫu phản ứng bao gồm cơ chất p NPG, α-glucosidase và dung dịch chứa hoạt chất AIGs.
2.2.2.4. Hoạt lực kìm hãm α-glucosidase (giá trị IC50)
IC50 (Inhibitory concentration) là nồng độ của hoạt chất mà có thể kìm hãm được 50% hoạt độ enzyme (trong trường hợp này là α-glucosidase) (theo phương pháp của Jing
và cộng sự 2007) [99]. IC50 được xác định bằng cách khảo sát hoạt tính kìm hãm của hoạt chất với enzyme ở các nồng độ khác nhau. Nếu hoạt lực kìm hãm enzyme của hoạt chất biến thiên tuyến tính với nồng độ, chúng ta sẽ vẽ được một đường thẳng y = ax+b (với y là
% hoạt tính kìm hãm và x là nồng độ). Nếu hoạt lực kìm hãm enzyme của hoạt chất không biến thiên tuyến tính với nồng độ, một cách gần đúng, chúng ta chọn 2 nồng độ kìm hãm trên và dưới 50% và cũng vẽ được đường thẳng y = ax+b. Thay y = 50% vào phương trình ta sẽ thu được giá trị x, đó chính là IC50. Một số công trình nghiên cứu đã làm sáng tỏ rằng hoạt tính kìm hãm α-glucosidase khác nhau khi sử dụng -glucosidase có nguồn gốc khác nhau. Với mục tiêu là tạo được AGIs và ứng dụng cho bệnh nhân ĐTĐ nên chúng tôi lựa chọn -glucosidase từ chuột cho các thí nghiệm định tính và định lượng hoạt tính kìm hãm α-glucosidase.
2.2.3. Xác định hàm lượng protein, lipit, carbonhydrate và độ ẩm trong các sản phẩm thực phẩm
Xác định hàm lượng protein (%), theo AOAC 991,20 [40]; Xác định hàm lượng lipit(%), theo AOAC 991,36 [41]; Xác định độ ẩm (%) theo TCVN 4326: 2001 (ISO 6496:1999) [21].
2.2.4. Phương pháp phân tích cảm quan
Đánh giá cảm quan thực phẩm thực hiện theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 3215 – 79.
Sử dụng phép thử thị hiếu để đánh giá mức độ ưa thích đối với sản phẩm. Người thử sẽ được mời nếm sản phẩm và đo mức độ ưa thích, hài lòng của mình đối với từng mẫu sản phẩm. Thang điểm sử dụng từ 1 – 9 (Hình 2.1)
Khả năng phân biệt sản phẩm về mặt thị hiếu của các thang đo thang 9 điểm thị hiếu:
□ □ □ □ □ □ □ □ □
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Hình 2.1 Thang thị hiếu chín điểm
Thang điểm được định nghĩa trước thông qua các thuật ngữ mô tả mức độ hài lòng, ưa thích đối với sản phẩm:
1 – cực kì ghét 2 – rất ghét 3 – tương đối ghét 4 – hơi ghét
5 – không thích cũng không ghét
6 – hơi thích 7 – tương đối thích 8 – rất thích
9 – cực kì thích
Sự khác nhau giữa các sản phẩm được kiểm định bằng phương pháp phân tích phương sai ANOVA mô hình S*A (S: người thử, A: sản phẩm). Sau đó tính LSD (giá trị khác nhau nhỏ nhất) để kiểm định hậu nghiệm (Hà Duyên Tư, 2006) [5].
2.2.5. Phương pháp tính toán, đánh giá hiệu quả tinh sạch chế phẩm AGIs kỹ thuật
Hiệu quả tinh sạch chế phẩm AGIs được đánh giá qua các thông số cơ bản như hiệu suất thu hồi, độ sạch.
- Hiệu suất thu hồi Y(%):
Công thức:
TA0: tổng AGIs có trong mẫu thô; TA1: tổng AGIs có trong mẫu sau tinh chế - Độ sạch P (%):
- Công thức: P = CAGIs x 100/ A
với A: Hàm lượng mẫu; CAGIs: Hàm lượng AGIs của mẫu.
2.2.6. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu an toàn thực phẩm
- Xác định tổng số vi khuẩn yếu khí, nấm men, nấm men, nấm mốc trong các sản phẩm thực phẩm theo TCVN 4886-89 [26]; Xác định E.coli, theo TCVN 6846:2007 [30];
Xác định Salmonella, theo TCVN 4829:2005 [22]; Xác định Staphylococcus aureus, theo TCVN 4830:2005 [23]; Xác định Clostridium perfringens, theo TCVN 4991:2005 [27];
Xác định Bacillus cereus, theo TCVN 4992:89 [28]; Xác định aflatoxin, theo TCVN 7596:2007 [31]; Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí, theo TCVN 4884:2005 [25]; Tổng bào tử nấm men – mốc TCVN 6265:2007 [29]; Xác định Coliforms, theo TCVN 4882:2007 [24].
- Xác định hàm lượng chì, theo AOAC 994.02 [39]; Xác định Asen, theo AOAC 952,13 [37]; Xác định hàm lượng cadimi, theo AOAC 2000 [36]; Xác định hàm lượng thủy ngân, theo AOAC 971,21 [38]; Xác định hàm lượng đồng, theo ISO 8294:1994 [91]; Xác định hàm lượng 3-MCPD, theo TCVN 7731: 2007 [32].
2.2.7. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, lập lại ít nhất 3 lần. Số liệu được xử lý trên phần mềm thống kê Irristat 4.0 và thống kê toán học.