Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Các nguồn vi sinh vật và vật liệu
- Ba mẫu mốc tương Bần, Yên Nhân, Hưng Yên; 3 mẫu mốc tương Cựu Đà, Thanh Oai, Hà Nội; 3 mẫu đỗ đen mốc ở Bần Yên Nhân, Hưng Yên; 3 mẫu đỗ đen mốc ở Cựu Đà, Thanh Oai, Hà Nội; 3 mẫu đỗ xanh mốc ở Cựu Đà, Thanh Oai, Hà Nội; 2 mẫu đỗ tương mốc ở Chợ Đồng Xuân – Hà Nội và 2 mẫu gạo mốc ở Chợ Đồng Xuân – Hà Nội.
- Đỗ đen xanh lòng, đỗ đen trắng lòng, đỗ tương (VN93 - 4), đỗ xanh (ĐX 11), gạo nếp cái hoa vàng (nếp cái hoa vàng Kinh Môn), cám gạo, trấu.
- Đỗ đen xanh lòng dùng trong nghiên cứu đã được xác định thành phần hóa học và tính chất vật lý: Có khối lượng 1000 hạt là 118,85 g, dung trọng 807,3 ± 0,8 g/l, độ ẩm 12,73 ± 0.26 %, Gluxit 52,16 ± 0,21%, tro tổng số 3,35%, protein 23,55 ± 0.2 % và thành phần axit amin g/100 g là: 3,85 g Threonin, 5,23 g Valine, 1,52 g Methionine, 1,46 g Isoleucine, 1,14 g Leucine; 1.25 g Phenylalanine, 0.40 g Tryptophan và 1,24 g Lysine.
- Cám gạo dùng trong nghiên cứu: Cám gạo từ lúa gạo sau khi xay xát được diệt enzyme lipase bằng phương pháp sấy cám ở nhiệt độ 100-1050C / 10 phút, thành phần:
độ ẩm 7,2%, Protein (13,2 % ), Lipit (17,5 %), Sợi thô (9,3 %), carbohydrate (37,6%), Tro thô (7,2%), Canxi (0,74 mg/g), Magie (8,2 mg/g), Photpho (15,4 mg/g), Phytin phot pho (9,7 mg/g), Silica (8,7 mg/g), Kẽm (41 mg/g), Vitamin B1 (17,5 mg/g) và Vitamin B2 (3,8 mg/g)
- Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng, chủng Swiss, có trọng lượng 20 ± 2 g, cả đực cả cái, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp. Động vật được nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm với đầy đủ thức ăn và nước uống tại nơi thí nghiệm từ trước khi nghiên cứu 5 ngày và trong suốt thời gian nghiên cứu.
2.1.2. Hóa chất
α-glucosidase từ ruột non chuột (rat interstinal aceton power), p-Nitrophenyl α-D- glucopyranoside (PNP-G), NaCL, Tris Base, đệm phosphat 0,1 M (lấy từ Sigma Chemical Co, Mỹ), đệm phosphate 0,5M pH 6,7 (Trung Quốc); acarbose (Glucobay, 100mg) (Bayer Medical Co. Leverkusen, Đức)... Các hóa chất thông dụng…
2.1.3. Môi trường
2.1.3.1. Môi trường nuôi cấy phân lập và giữ giống
Môi trường Czapek-Dox (g/l): NaNO3 3; KCl 0,5; MgSO4.7H2O 0,5; FeSO4.7H2O 0,01; ZnSO4.7H2O 0,01; CuSO4.7H2O 0,005; aga 20 (nếu là môi trường lỏng thì không có aga ); nước cất 1000ml, pH = 5,0. Thanh trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút.
2.1.3.2. Môi trường nghiên cứu định loại Aspergillus [107]
Khi phân loại nấm mốc bằng chỉ tiêu hình thái học, sử dụng loại môi trường sau:
- Môi trường Czapek concentrate (bổ sung kim loại vết) g/100ml: NaNO3 30;
KCL 5,0; MgSO4.7H2O 5; FeSO4.7H2O 0,1; ZnSO4.7H2O 0,01; CuSO4.5H2O 0,05;
nước cất 100 ml.
- Môi trường Czapek Yeast Agar với 20% sucrose (CYA20S) g/l: K2HPO4 1; Môi trường Czapek concentrate 10ml; cao nấm men 5,0; sucrose 200; agar 15; nước cất 1000 ml.
- Môi trường Czapek Dox Agar (CZ) g/l: K2HPO4 1; Môi trường Czapek concentrate 10ml; sucrose 30; agar 17,5; nước cất 1000 ml.
- Môi trường Czapek Yeast Agar (CYA25, CYA37) g/l: K2HPO4 1,0; Môi trường Czapek concentrate 10ml; cao nấm men 5,0; sucrose 30; agar 15; nước cất 1000 ml.
Các môi trường được khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong 30 phút sau đó phân phối 25 ml mụi trường vào mỗi đĩa petri (ỉ100mm) vụ trựng.
2.1.3.3. Môi trường đậu đỗ giá thể rắn
Đậu đỗ rửa sạch, ngâm nước 10 giờ ở nhiệt độ phòng, để ráo 5 phút, hấp chín ở nhiệt độ 1210C trong vòng 60 phút.
2.1.3.4. Các môi trường rắn cho nhân giống
Năm môi trường nhân giống với thành phần tỷ lệ khối lượng (g/g) như sau:
- M1 có tỷ lệ: Bột ngô : trấu là 4 : 1 - M2 có tỷ lệ: Đỗ tương : trấu là 4 : 1 - M3 có tỷ lệ: Cám gạo : trấu là 4 : 1
- M5 có tỷ lệ: Cám gạo : gạo : trấu là 2 : 2 : 1 Các môi trường này đều có độ ẩm 50% và pH 5,5.
2.1.3.5. Đỗ đen lên men
Đỗ đen lên men là bột của môi trường (đỗ đen xanh lòng) sau lên men bằng A.oryzae T6, được sấy ở nhiệt độ 600C, hàm ẩm đạt khoảng 5% và nghiền thành bột (trình bày ở chương 4).
2.1.4. Thiết bị
Các thiết bị: Tủ sấy (Trung Quốc), máy đo quang (Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech), nồi thanh trùng (Trung Quốc), tủ cấy vô trùng (Labgard, Mỹ), tủ lạnh (Sanyo, Nhật Bản), tủ nuôi lắc (Nhật Bản), kính hiển vi quang học (Olympus –CH2, Nhật Bản) máy đánh sóng siêu âm ultrasonic LC30, máy li tâm (Đức), hệ thống trich ly và cô chân không quy mô 70 lít/mẻ. Thiết bị siêu âm TJS-3000 intelligent Ultrasonic Generator V6.0 (do Công ty Hangzhou Success Ultrasonic Equipment Co.,Ltd sản xuất), bể siêu âm dung tích 20 lít, tần số 20 kHZ và công suất tối đa 3000 W...
2.1.5. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.5.1. Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu thực hiện tuyển chọn A.oryzae, lên men bề mặt, chiết xuất AGIs, tinh sạch AGIs, tạo chế phẩm AGIs và ứng dụng chế phẩm cho sản xuất TPCN tại phòng thí nghiệm của Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, phòng thí nghiệm của Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch và Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội. Nghiên cứu xác định khối lượng phân tử và trình tự amino acid bằng khối phổ bằng thiết bị MALDI- TOF/TOF mass spectrometer được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Proteomics International Pty Ltd. Địa chỉ: Box 3008, Broadway, Nedlands, Western Australia 6009.
2.1.5.2. Thời gian nghiên cứu
Thời gian đào tạo theo hệ không tập trung 4 năm (2010 – 2014). Thời gian nghiên cứu của nghiên cứu sinh cho đến khi hoàn thành các nội dung nghiên cứu theo đề cương của đề tài: 5/ 2010 - 5/ 2014.