Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.6. Tinh sạch và định lượng AGIs từ đỗ đen lên men
2.3.6.1. Khảo sát dung môi cho tinh sạch sơ bộ AGIs
Mỗi mẫu 2,28 gam chế phẩm AGIs (chiết xuất từ 100 gam đỗ đen lên men bề mặt) hòa tan trong 100 ml nước cất, sau đó kết tủa từng mẫu trong 900 ml: (ethanol, methanol và isopropyl alcohol), để ở nhiệt độ 250C, sau 24 giờ đem ly tâm tách từng phần kết tủa và
dịch lọc mỗi mẫu. Sau đó đem sấy khô để loại dung môi ở từng phần của các mẫu rồi xác định lượng chất khô và hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (mục 2.2.2)
2.3.6.2. Khảo sát nồng độ ethanol cho tinh sạch sơ bộ AGIs
Mỗi mẫu 2,28 gam chế phẩm AGIs hòa tan trong 100 ml nước cất, sau đó kết tủa từng mẫu trong 900 ml ethanol 70, 75, 80, 85, 90 và 95%, để ở nhiệt độ 250C sau 24 giờ đem ly tâm tách từng phần kết tủa và dịch lọc mỗi mẫu. Sau đó đem sấy khô để loại dung môi ở từng phần của các mẫu rồi xác định lượng chất khô và hoạt tính kìm hãm α- glucosidase (mục 2.2.2).
2.3.6.3. Thu nhận AGIs [124]
Sử dụng các enzyme thủy phân để xác định bản chất của AGIs từ đỗ đen lên men sau khi tinh sạch sơ bộ bằng ethanol 90% có phải là peptide hay không. 0,32 gam bột chế phẩm AGIs tinh sạch sơ bộ bằng ethanol 90% hòa tan trong 100 ml nước cất, sau đó xác định AGIs có phải là peptide theo phương pháp của Min-Gu-Kang và cộng sự, năm 2013 [124] là xử lý bằng các enzyme thủy phân (1%) lần lượt với pepsin, trypsin, pancreatin, α- amylase, α-glucosidase, sau các phản ứng với các enzyme thủy phân được vô hoạt enzyme ở nhiệt độ 1000C trong 10 phút, loại bỏ kết tủa, rồi thu dịch lọc bằng ly tâm tốc độ 10000 rpm, 25 phút ở nhiệt độ 40C. Dịch lọc thu được thêm nước cất đạt 100 ml, đem xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (mục 2.2.2).
2.3.6.4. Tinh sạch AGIs bằng RP - HPLC [124]
Sau khi, chế phẩm AGIs tinh sạch sơ bộ bằng ethanol 90% và xử lý bằng 1% pepsin (mục 2.3.6.3) tiến hành tách phân đoạn bằng RP - HPLC (cột C18 5 mm, 4,6 x 250 mm).
Đầu tiên cột được cân bằng với acetonitrile. AGIs sẽ được rửa giải bằng phương pháp gradient với dải nồng độ từ 0% đến 50% acetonitrile (v/v) trong đệm 0,1 TFA với tốc độ dòng là 0,8 ml/phút. AGIs được phân tích bằng cách xác định khả năng hấp thụ tại bước sóng 280 nm. Thể tích mỗi phân đoạn thu được là 1ml. Các phân đoạn sau khi xác định có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase sẽ được làm đông khô tạo chế phẩm AGIs tinh sạch. Sau đó, chế phẩm được kiểm tra độ tinh sạch bằng cách phân tích định lượng trên hệ thống RP - HPLC.
- Chuẩn bị đệm Phosphate: Potassium phosphate được cân chính xác khoảng 6,8 gam và bổ sung nước cất đến 1000 ml.
- Chuẩn bị pha động: Pha động đã được chuẩn bị bằng cách trộn 50 thể tích acetonitrile và 50 thể tích 0,05 M phosphate buffer cùng với 0,1% TFA. Dung dịch cho pha động được lọc khí bằng siêu âm, lọc qua màng lọc 0,45mm và khử khí.
- Tiến hành phân tích: Đưa dịch mẫu sau khi được sử lý sơ bộ bằng ethanol và pepsin lên cột bằng kim tiêm tự động với tốc độ 0,5 ml/phút. Chạy chương trình gradient với dải nồng độ từ 0% đến 50% của dung dịch pha động với tốc độ 0,8 ml/phút. Sử dụng bộ phận thu mẫu tự động để thu các phân đoạn với thể tích là 1ml/phân đoạn. Các phân đoạn thu được sẽ đem đánh giá lại hoạt tính. Các phân đoạn có hoạt tính sẽ được đem đông khô và kiểm tra lại độ tinh sạch bằng RP - HPLC, xác định được hoạt tính của AGIs.
2.3.6.5. Xác định khối lượng phân tử và trình tự amino acid của AGIs bằng khối phổ
Xác đinh được khối lượng phân tử và trình tự amino acid của AGIs. Mẫu chế phẩm AGIs tinh sạch, xử lý xử lý mẫu bằng trypsin, chiết xuất được peptide và phân tích bằng thiết bị MALDI-TOF/TOF mass spectrometer theo phương pháp của Bringans và cộng sự năm 2008 [49]. Phổ AGIs được phân tích bằng phần mềm Mascot và dữ liệu ngân hàng Ludwig NR hoặc SwissPro. (Phân tích mẫu được thực hiện bởi Proteomics International Pty Ltd. Địa chỉ: Box 3008, Broadway, Nedlands, Western Australia 6009) (Phụ luc KQ KP).
2.3.6.6. Định lượng peptide AGIs bằng RP - HPLC [72]
Peptide AGIs sau khi tinh sạch bằng RP - HPLC (xem mục 2.3.6.4) có được sản phẩm peptide AGIs tinh sạch dưới dạng đông khô, dùng peptide AGIs này làm chất chuẩn, tiến hành sắc ký, dựng đường chuẩn peptide AGIs và thông qua diện tích của các píc sắc ký đồ chạy RP - HPLC tương ứng với các nồng độ khác nhau của sản phẩm AGIs, tính được hàm lượng peptide AGIs.
- Chuẩn bị đệm Phosphate và chuẩn bị pha động (xem mục 2.3.6.4)
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Dung dịch chuẩn được chuẩn bị bằng cách cân chính xác 125 mg AGIs đã được phân tích khối phổ và hòa tan trong 5 ml pha động.
- Tiến hành phân tích: Đưa mẫu dung dịch chuẩn lên cột bằng kim tiêm tự động ở cỏc thể tớch khỏc nhau 10, 20, 30, 40, 50 àl tốc độ 0,5 ml/phỳt. Chạy chương trỡnh gradient
từng nồng độ. Đưa mẫu dịch sau khi được sử lý sơ bộ bằng ethanol và pepsin lên cột bằng kim tiêm tự động với tốc độ 0,5 ml/phút.
Có được đường chuẩn peptide AGIs, xác định được diện tích píc của sản phẩm peptide AGIs trong dịch lên men. Từ đây suy ra được nồng độ peptide AGIs cần tìm trong dịch chiết đỗ đen lên men.