CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
2.2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư
Ho t tính g y đ c dòng tế bào ung thư trên 5 dòng tế bào ung thư ở người bao gồm ung thư gan (Hep-G2) ung thư ph i (LU-1) ung thư vú (MCF-7), ung thư b ch cầu cấp (HL-60), ung thư da (SK-Mel-2). Phép thử được thực hiện t i Phòng Thử nghiệm sinh học – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm KH và CN Việt Nam.
+ Phương pháp SRB
Phương ph p thử đ đ c tế bào ung thư in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử đ đ c tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở đi u kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương ph p của Monks (1991) [70]. Phép thử tiến hành x c đ nh hàm lượng protein tế bào t ng số dựa vào mật đ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhu m bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá tr OD m y đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein do đ lượng tế bào càng nhi u (lượng protein càng nhi u) thì giá tr OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong đi u kiện cụ thể như sau:
Pha chất thử thành c c dải nồng đ thích hợp.
- Trypsin h a tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để đi u chỉnh mật đ cho ph hợp với thí nghiệm.
- Chất thử đã pha ở c c nồng đ vào c c giếng của đĩa 96 giếng th m tế bào đã đi u chỉnh nồng đ ph hợp ở tr n vào c c giếng này sao cho nồng đ chất thử trong giếng là 100 àM; 20 àM; 4 àM và 0,8 àM
- Ủ trong tủ ấm 48 giờ. Giếng không có chất thử nhưng c tế bào ung thư (190l) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố đ nh bằng Trichloracetic acid – TCA.
- Sau 48 giờ, tế bào được cố đ nh bằng TCA trong 1 giờ được nhu m bằng SRB trong 30 phút ở 37 oC, rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô ở nhiệt đ phòng.
10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB, lắc nhẹ trong 10 phút.
- Đọc kết quả OD ở bước sóng 515-540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad).
- Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được x c đ nh thông qua công thức sau:
Phép thử được lặp l i 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine ở các nồng đ 10 g/ml;
2 g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/ml được sử dụng như là chất đối chứng dương;
DMSO10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá tr IC50 (nồng đ ức chế 50%
sự phát triển) sẽ được x c đ nh nhờ vào phần m m máy tính TableCurve 2Dv4.
+ Phương pháp MTT
Phương ph p thử đ đ c tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute - NCI) xác nhận là phép thử đ đ c tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng g y đ c tế bào ở đi u kiện in vitro. Phương ph p này lần đầu ti n được mi u tả bởi Tim Mosmann năm 1983 [71]. Sử dụng muối tetrazolium (MTT - (3-(4,5-dimethylthiazol-2 - yl)- 2, 5 - diphenyltetrazolium)) làm thuốc thử trong phép so màu qua đ đ nh gi v sự sống s t và khả năng ph t triển của tế bào. Vòng tetrazolium của thuốc thử b m chặt vào ti thể của tế bào ho t đ ng.
Dưới t c dụng của enzym dehydrogenase trong tế bào màu vàng của MTT biến đ i thành màu tím formazan. Phép thử được thực hiện trong đi u kiện cụ thể như sau:
- Chất thử (20 l) được đưa vào c c giếng của khay 96 giếng để c nồng đ 100 àM;
20 àM; 4 àM và 0,8 àM
- Sau khi đi u chỉnh để c mật đ tế bào ph hợp hút 180 l tế bào vào c c giếng của khay 96 giếng đã c chất thử. Tr n c ng m t đĩa thử bố trí m t số giếng để làm đối chứng không có mẫu thử, chỉ có dung môi pha mẫu là DMSO10%.
- Để đĩa nuôi cấy vào trong tủ ấm CO2 ở đi u kiện 37oC, 5% CO2, trong thời gian 72h.
- Sau 72 giờ 10àl MTT (nồng đ cuối c ng là 5mg/ml) được cho vào m i giếng.
-Sau 4h lo i bỏ mụi trường tinh thể formaran được hũa tan bằng 50àl (DMSO) 100%.
- Gi tr OD đo ở bước s ng 540 nm bằng m y quang ph . - Lượng tế bào sống sót sẽ được tính theo công thức:
- Các phép thử được lặp l i 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine (Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng đ 10
g/ml; 0.2 g/ml; 0.04 g/ml; 0.008 g/ml.
- DMSO10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá tr IC50 (nồng đ ức chế 50%
sự phát triển) sẽ được x c đ nh nhờ vào phần m m máy tính TableCurve 2Dv4.
2.2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm
Ho t tính kháng viêm in vitro thông qua ức chế sản sinh NO trong tế bào vi mô não của chu t (BV2) được thực hiện t i Khoa Dược Đ i học Wonkwang, Hàn Quốc.
Ho t tính kháng vi m được đ nh gi thông qua 4 bước:
Bước 1: Chuẩn b
- Tế bào BV2 được nuôi trong môi trường DMEM có b sung FBS 10%
(GIBCO), penicilin (100 unit/mL), streptomicin (100mg/mL) và L-glutamine (2 mM) trong 3-5 ngày ở đi u kiện 37oC, 5% CO2.
Bước 2: Kiểm tra đ c tính của các chất thử đối với tế bào BV2 theo phương pháp so màu MTT.
- Các mẫu thử được pha trong DMSO và pha loãng bằng môi trường nuôi cấy tế bào đến nồng đ phù hợp. Chất thử được đưa vào c c giếng của khay 96 giếng để có nồng đ tương tự nồng đ của thí nghiệm NO. Sau đ đi u chỉnh để c mật đ tế bào ph hợp hút 180 l tế bào vào c c giếng của khay 96 giếng đã c chất thử. Tr n c ng m t đĩa thử bố trí m t số giếng để làm đối chứng không có mẫu thử, chỉ có dung môi pha mẫu.
- Để đĩa nuôi cấy vào trong tủ ấm CO2 ở đi u kiện 37oC, 5% CO2. Sau 72 giờ 10àl dung d ch MTT (nồng đ cuối c ng là 0 5 mg/mL) được cho vào m i giếng. Sau
4 giờ lo i bỏ mụi trường tinh thể formaran được hũa tan bằng 50àl (DMSO) và đo giá tr đ hấp thụ (OD) ở bước sóng 540 nm bằng máy quang ph .
- Phần trăm tế bào sống sót sẽ được tính theo công thức:
Bước 3: Đ nh gi khả năng ức chế sự sản sinh NO trong tế bào BV2
Các tế bào được đưa vào đĩa 96 giếng ở nồng đ 5 x 104 tế bào/giếng và nuôi trong tủ ấm ở 37oC và 5% CO2 trong 24 giờ. Lo i bỏ môi trường nuôi cấy thay bằng môi trường DMEM không có FBS trong 3 giờ. Tế bào sau đ được ủ mẫu nghiên cứu ở các nồng đ khác nhau trong 2 giờ trước khi được kích thích sản sinh yếu tố NO bằng LPS (1 μg/mL) trong 24 giờ.
- M t số giếng không được ủ mẫu mà chỉ sử dụng dung d ch pha mẫu được coi là đối chứng m. Trong khi đối chứng dương được sử dụng là butein (10 àM).
- Nitrite (NO2-) được xem là chỉ th cho việc t o NO, sẽ được x c đ nh nhờ b Griess Reagent System (Promega Cooperation, WI, USA). Cụ thể là, 100 μL môi trường nuôi tế bào (ủ mẫu) được chuyển sang đĩa 96 mới và được th m vào 100 μL Griess reagent (50 μL of 1% (w/v) sulfanilamide trong 5% (v/v) acid phosphoric và 50 μL 0 1%
(w/v) n-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride pha trong nước) [72].
- H n hợp này được ủ tiếp ở nhiệt đ phòng trong 20 phút và hàm lượng nitrite sẽ được đo bằng máy ELISA plate reader ở bước s ng 525 nm. Môi trường DMEM không FBS được sử dụng như giếng trắng (blank).
- Hàm lượng nitrite của t ng mẫu thí nghiệm được x c đ nh nhờ vào đường cong hàm lượng chuẩn NaNO2 và được so sánh % với mẫu chứng âm (LPS). Khả năng ức chế sản sinh NO của mẫu được x c đ nh nhờ công thức:
% ức chế = [hàm lƣợng NOmẫu/hàm lƣợng NOLPS]×100%
- Butein (10 àM) được sử dụng làm chất đối chứng dương suốt quỏ trỡnh thử nghiệm.
Bước 4: Phương pháp xử lý số liệu.
Các thí nghiệm đ nh gi ảnh hưởng của các hợp chất phân lập được đến sự sản sinh NO trong tế bào BV2 được thực hiện ít nhất 3 lần và lấy giá tr trung bình. Phân tích số liệu, xây dựng đồ th và tính toán giá tr IC50 (theo phương ph p hồi qui
Sigmoidal dose-response) được thực hiện trên phần m m Microsoft Excel 2016 và GraphPad Prism 6.0.
2.2.3.1. Phương pháp đánh giá cơ chế chống ung thư
Đ nh gi cơ chế chống ung thư đối với dòng tế bào ung thư vú ở người MCF-7.
Phép thử được thực hiện t i Trung tâm Tiên tiến v Hóa sinh hữu cơ – Viện Hóa sinh biển– Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam.
Dòng tế bào ung thư vú người MCF-7 được cung cấp bởi GS. Jeong-Hyung Lee trường ĐHQG Kangwon Hàn Quốc. Tế bào ung thư được nuôi cấy in vitro theo phương ph p Mosmann và c ng sự [71]. Tế bào nuôi cấy ở 37oC trong môi trường DMEM có b sung huyết thanh nhau phôi bò 10% (FBS), 100U/ml penicillin và 100àg/ml streptomycin trong tủ nuụi cấy CO2 5% trong 48 giờ.
Phương pháp phân tích hàm lượng DNA của tế bào bằng máy trắc lưu tế bào (cell cycle analysis)[73].
Tế bào ung thư vú người MCF-7 được nuôi cấy trong c c đĩa petri 100mm x 20mm trong môi trường DMEM ở 37oC, 5% CO2 với 10% FBS, penicillin (100 u/mL) và streptomycin sulphate (100àg/mL) với mật đ 2.5 x 105 tế bào. Sau 24 giờ, chỳng được ủ với các chất thử nghiệm ở các nồng đ khác nhau trong DMSO. Sau 48h, cố đ nh tế bào bằng trypsin và ly t m 1000xg 5 phút để thu cặn tế bào. Rửa cặn tế bào bằng PBS sau đ cố đ nh tế bào trong ethanol 70% trong 2 giờ ở 4oC. Sau đ ly t m và rửa cặn tế bào 2 lần bằng PBS. 500àL d ch tế bào được b sung 5 àL RNAse (2,5 mg/mL) và 2,5 àL propidium iodide (Invitrogen, USA, 1 mg/mL). Dung d ch trờn được ủ ở 37oC 30 phút sau đ ph n tích bằng máy trắc lưu tế bào. Kết quả được phân tích bằng phần m m NovoExpress dưới d ng biểu đồ.
Phương pháp phân tích quá trình tự chết của tế bào (apoptosis) [73]
Tế bào ung thư vú người MCF-7 được nuôi cấy trong c c đĩa petri 100mm x 20mm trong môi trường DMEM ở 37oC, 5% CO2 với 10% FBS, penicillin (100 units/mL) và streptomycin sulphate (100àg/mL) với mật đ 2.5 x 105 tế bào. Sau 24 giờ chúng được thử với hợp chất pha sẵn ở các nồng đ khác nhau trong DMSO. Sau 48h, thu cả phần d ch n i và phần tế bào bám dính và ly tâm 1000xg, 5 phút. Hút bỏ d ch n i và rửa cặn tế bào bằng PBS. Hũa tan cặn tế bào với 300 – 500 àL binding buffer (t y lượng tế bào). Với m i 100àL d ch tế bào, b sung 5 μL Invitrogen và 1 μL PI (100 μg/mL) sau đ ủ d ch tế bào ở nhiệt đ phòng tr nh nh s ng trong 15 phút.
B sung 400 àL binding buffer và phõn tớch bằng mỏy trắc lưu tế bào. Kết quả được phân tích bằng phần m m NovoExpress dưới d ng biểu đồ.
Quan sát sự thay đổi hình thái tế bào dưới kính hiển vi (Microscope observation) Để đ nh gi t c đ ng của các hợp chất lên hình thái tế bào ung thư vú người MCF-7, tế bào được nuôi trong các đĩa nuôi cấy 100 mm (mật đ 5 x 104 tế bào). Sau 24h, tế bào được ủ với hợp chất ở các nồng đ thử nghiệm (ngo i tr đĩa đối chứng).
Sau 48h, tế bào được quan sát bằng kính hiển vi soi ngược CKX53 (Olympus Corporation, Tokyo, Japan) với đ ph ng đ i vật kính là 10X và 20X