2.4. Tổng quan về vi khuẩn nội sinh
2.4.4. Vai trò của vi khuẩn nội sinh
Vi khuẩn nội sinh sống trong mô thực vật, không gây hại cho cây mà ngược lại giúp cây phát triển tốt, khỏe mạnh nhờ các đặc tính tốt của chúng.
2.4.4.1. Khả năng cố định đạm
Đạm là chất dinh dưỡng rất cần thiết và quan trọng cho sự phát triển của thực vật. Trong không khí có 78% N2 nhưng cây trồng không thể hấp thụ trực tiếp N2 trong không khí. Vì vậy, sự cố định đạm sinh học do sự liên kết giữa vi khuẩn với cây trồng thật sự rất có ý nghĩa.
Sự cố định đạm sinh học ở vi sinh vật sơ hạch, chủ yếu là ở vi khuẩn và cổ vi khuẩn (Archaea). Nhóm vi sinh vật này có thể sống tự dưỡng hay dị dưỡng và quá trình cố định đạm của chúng cần nguồn năng lượng, chủ yếu là nguồn carbohydrate do cây chủ cung cấp, do đó nguồn năng lượng càng dồi dào thì sản lượng đạm cố định càng cao. Trong quá trình cố định đạm sinh học, khâu then chốt của toàn bộ chu trình nitơ là sự khử liên kết của N2 thành NH3 nhờ vào nguồn năng lượng ATP, sự hoạt động của phức hợp enzyme nitrogenase và enzyme hydrogenase.
* Cấu tạo của enzyme nitrogenase
Phức hệ enzyme nitrogenase, enzyme này tác động phá vỡ liên kết ba N với N (N≡N). Nitrogenase bao gồm 2 thành phần protein:
- Dinitrogenase (MoFe-protein): có trọng lượng phân tử khoảng 240 KDa, cấu tạo từ 2 tiểu đơn vị khác nhau chứa nhân Fe, Mo và tâm oxy hóa khử. Dinitrogenase có chứa cofactor MoFe hoặc MoFe-co.
- Dinitrogenase reductase (Fe-protein): protein nhỏ hơn, có trọng lượng phân tử khoảng 60 KDa, gồm 2 tiểu đơn vị giống nhau, chứa tâm oxy hóa - khử Fe4-S4, có 2 vị trí gắn ATP.
Nitrogenase
Hình 2.4. Cấu trúc enzyme Nitrogenase (Nachiket et al., 2010)
* Cơ chế cố định đạm
Theo Kneip et al., (2007), trong suốt quá trình cố định đạm sinh học N2
giảm trong hệ thống vận chuyển điện tử kết quả tạo NH3 và phóng thích H2. NH3 sau đó được sử dụng để tổng hợp các chất khác. Quá trình chuyển N2
thành NH3 được xúc tác bởi phức hệ enzyme nitrogenase với sự tham gia của năng lượng ATP. Enzyme dinitrogenase reductase và dinitrogenase có các tiểu đơn vị nif (γ2 homodimeric azoferredoxin) và NifD/K (α2ò2 heterotetrameric molybdoferredoxin). Điện tử chuyển từ ferredoxin (hoặc flavodoxin) đến dinitrogenase reductase và chuyển đến dinitrogenase, cung cấp điện tử dưới dạng H2 đến các N2 tạo thành NH3. Mỗi mol N2 được cố định cần có 16 ATP và có sự tham gia của protein nifH .
Phức hợp enzyme nitrogenase và enzyme hydrogenase tổng hợp N2
thành NH3 theo sơ đồ sau:
N2 + 6H+ + 6e- 2NH3
Hình 2.5. Sơ đồ biểu diễn cơ chế cố định N2 (Nachiket et al., 2010)
Ammonia được tạo ra trong chu trình tiếp tục kết hợp với chuỗi carbon để đồng hóa thành những acid amin đầu tiên cung cấp trực tiếp cho cây trồng.
Hình 2.6. Sơ đồ biểu diễn cơ chế cố định đạm sinh học (Kneip et al., 2007) Nitrogenase là một phức hệ enzyme, enzyme này được điều khiển bởi hệ thống gen nif có trong bộ genome của tế bào vi khuẩn. Enzyme nitrogenase không chỉ xúc tác cho quá trình tổng hợp N2 thành NH3, mà còn có thể xúc tác khử các chất CH3CN, HCN, NH3, N2O, C2H2, ... thành các sản phẩm tương ứng như C3H6, CH4, H2, N2, C2H4.
* Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định đạm
NH3 được tạo nên bởi nitrogenase được đưa đến tế bào chất của tế bào chủ và ở đây được sử dụng để tổng hợp acid amin. Sự tổng hợp enzyme nitrogenase được điều khiển bởi enzyme glutamate synthetase, xúc tác tổng hợp glutamin từ NH3. Nếu trong hệ thống có ít NH3 thì glutamate synthetase kích thích tổng hợp nitrogenase, nồng độ NH3 cao thì ức chế tổng hợp nitrogenase. Cơ chế này rất có ý nghĩa, tuy nhiên khi cung cấp NH3 dư thừa thì nitrogenase không được sử dụng, vì đã có đủ NH3 (Van và Sloger, 1981).
Protein của nitrogenase là có thể bị biến tính khi tiếp xúc với oxy và chúng chỉ có thể hoạt động trong điều kiện yếm khí.
Ngoài ra, sự hoạt động của enzyme nitrogenase còn bị ảnh bởi các yếu tố khác như: nhiệt độ, pH, ...
2.4.4.2. Khả năng hòa tan lân khó tan
Vi khuẩn nội sinh thực vật ngoài khả năng cố định đạm sinh học còn có vai trò quan trọng trong việc hòa tan lân khó tan thành dễ tan như
orthophosphate cung cấp cho thực vật và làm tăng sản lượng (Rodriguez et al., 2006). Lân là một trong những chất dinh dưỡng rất cần thiết cho cây trồng.
Trong đất, lân tồn tại dưới hai dạng là lân hữu cơ và lân vô cơ. Lân hữu cơ tồn tại trong xác bã động, thực vật và trong vi sinh vật, thường là các hợp chất chủ yếu như phytin, phospholipid, acid nucleic và các hợp chất hữu cơ khác. Lân vô cơ trong đất thường ở trong các dạng khoáng như apatit, phosphat sắt, phosphat nhôm và các dạng này khó tan. Cây trồng chỉ có thể sử dụng được lân trong đất ở dạng hòa tan, lân dạng khó tan cây trồng không hấp thu được (Nguyễn Xuân Thành và ctv, 2007). Ở trong đất, lân dễ tan tồn tại với một lượng nhỏ, phần lớn tồn tại dưới dạng khó tan. Chính vì vậy, để đạt được năng suất cây trồng, người ta thường dùng các dạng phân lân dễ tan để bón cho cây.
Tuy nhiên, các dạng có thể hòa tan của phân lân khi bón vào đất lại dễ dàng bị cố định thành các dạng không hòa tan được như là: Ca3(PO4)2, Fe2(PO4)3 và AlPO4 nên cây khó hấp thu và dẫn đến việc bón phân lân vượt quá mức đối với đất trồng. Bón quá nhiều lân sẽ gây ra ô nhiễm môi trường đất (Chen et al., 2006).
Vi sinh vật tăng cường khả năng cung cấp lân cho thực vật theo nhiều cơ chế khác nhau:
- Kích thích sự phát triển của bộ rễ bằng cách tiết ra các hormone kích thích phát triển bộ rễ như IAA, ACC deaminase (Hayat et al., 2010).
- Sự hoạt động của vi sinh vật làm thay đổi các ion trong dung dịch đất, làm tăng khả năng chuyển hóa lân khó tan tạo ra các orthophosphate trong dung dich đất hoặc tác động trực tiếp hay gián tiếp đến sự chuyển hóa lân vô cơ (Seeling and Zasoski, 1993).
- Thông qua quá trình trao đổi chất của vi sinh vật đã tác động trực tiếp đến quá trình hòa tan và khoáng hóa lân từ các dạng lân hữu cơ và lân vô cơ (Richardon et al., 2009). Trong quá trình này tạo ra các ion hữu cơ như gluconate, oxalate, malate, lactate, citrate hoặc tạo ra các enzyme thủy phân như phosphatase, cellulases cần thiết cho quá trình thủy phân lân hữu cơ.
Thực vật sử dụng được lân hữu cơ là nhờ sự thủy phân bởi các enzyme phosphatase ngoại bào của thực vật hay của vi sinh vật. Theo Bu nemann (2008) 60% tổng lượng lân hữu cơ có thể bị thủy phân bởi phosphatase. Cả hai phosphatases thực vật và vi sinh vật đều có tác động hiệu quả trong việc tạo orthophosphate từ dạng lân hữu cơ trong đất. Một số bằng chứng cho thấy enzyme vi khuẩn cho hiệu quả cao hơn trong việc hòa tan lân (Tarafdar et al., 2001). Vi sinh vật có vai trò rất quan trọng giúp cho thực vật có thể hấp thu được lân.
Một số vi sinh vật như vi khuẩn, nấm có khả năng chuyển hóa lân vô cơ
Pseudomonas, Bacilllus, Rhizobium, Burkholderia, Achromobacter, Agrobacterium, Microccocus, Flavobacterium và Erwinia. Vi khuẩn hòa tan lân khó tan khi bổ sung vào thực vật làm tăng khả năng hấp thu lân (Chen et al., 2006). Matsuoka et al., (2013) phân lập được các dòng vi khuẩn nội sinh Bacillus sp., Pseudomonas từ rễ Carex kobobugi có khả năng hòa tan lân vô cơ và tạo ra siderophore trong điều kiện Fe và P cho phép. Các vi sinh vật hòa tan lân khó tan thành dễ tan bằng cách tiết ra acid. Các acid hữu cơ được sản xuất bởi vi khuẩn và nấm trong quá trình hòa tan lân khó tan chủ yếu là: citric, lactic, gluconic, oxalic, tartaric, acetic và 2-ketogluconic acid. Lượng lân được hòa tan phụ thuộc vào nhiều yếu tố như dạng lân vô cơ (bao gồm Canxi, sắt nhôm phosphate). Ngoài cơ chế acid hóa, các vi khuẩn còn có thể hòa tan lân khó tan bằng sự tạo phức và các phản ứng trao đổi ion (Khan và Doty, 2009).
2.4.4.3. Khả năng tổng hợp IAA
Indole-3-acetic acid (IAA) là dạng auxin, là chất điều hòa sinh trưởng của thực vật. IAA chi phối sự phân chia tế bào, sự giãn dài tế bào, phân hóa sinh mô, phát triển trái và hạt, chi phối giai đoạn đầu sự phát triển của cây trồng. Tác động của IAA phụ thuộc vào dạng tế bào, ở các nồng độ khác nhau tùy thuộc vào loại phân sinh mô, IAA kích thích đồng thời sự giãn dài trục lá mầm, ngăn cản sự sinh trưởng của rễ chính, kích thích sự khởi đầu của rễ bên và sự thành lập lông rễ (Theologies và Ray, 1982). Theo Sergeeva et al., (2002), các nhóm vi khuẩn khác nhau kể cả vi khuẩn đất, vi khuẩn biểu sinh, vi khuẩn nội sinh và một số vi khuẩn lam (Cyanobacteria) đã được phát hiện là có khả năng sinh tổng hợp indole-3-acid acetic từ tiền chất L-tryptophan (Trp).
Một số loài của các chi Azospirillum, Gluconacetobacter và Pseudomonas là những vi khuẩn cố định đạm, nhưng nhờ vào khả năng tổng hợp IAA của chúng nên cũng được xem là vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật, góp phần làm tăng sản lượng cây trồng (Kloepper et al., 1989).
Có 3 lộ trình tiêu biểu nhất cho sự biến đổi của L-tryptophan thành IAA đã được Koga et al., (1991) mô tả chi tiết như sau:
* Lộ trình indole-3-pyruvic acid
Tryptophan indole-3-pyruvic acid indole-3-acetaldehyde IAA
* Lộ trình tryptamine
Tryptophan tryptamine indole-3-acetaldehyde IAA
* Lộ trình indole-3-acetamide
Tryptophan indole-3-acetamide IAA
Carreủo-Lúpez et al., (2000) cũng nhận thấy trong cỏc lộ trỡnh tổng hợp IAA ở loài Azospirillum brasilense thì lộ trình indole-3-pyruvic acid vẫn là
con đường chủ yếu để tổng hợp IAA từ tiền chất tryptophan và được xúc tác chủ yếu bởi enzyme indole pyruvic decarboxylase (Costacurta et al., 1994).
2.4.4.4. Đối kháng sinh học
Một số vi khuẩn nội sinh có khả năng kiểm soát sinh học, vì chúng tạo ra các hợp chất kháng vi sinh vật giúp cho cây trồng hạn chế dịch bệnh.
Các chất kháng sinh là sản phẩm tự nhiên được xác định như phân tử hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp, với nồng độ thấp có khả năng chống lại vi sinh vật (Demain, 1981). Thường vi khuẩn nội sinh là nguồn cung cấp các chất kháng sinh này. Các sản phẩm tự nhiên của vi khuẩn nội sinh có khả năng tiêu diệt các yếu tố gây bệnh: các yếu tố gây bệnh thực vật như vi khuẩn, nấm, virus và động vật nguyên sinh và có hiệu quả đối với người và động vật.
Ecomycin là sản phẩm được tạo ra từ Pseudomonas viridiflava. Chúng được phân lập từ lá của các loài cỏ. Ecomycin hiện diện nhóm lipopeptid mới, ngoài ra còn có các amino acid phổ biến như alanine, serine, threonine và glycine và các amino acid đặc biệt. Ecomycin hoạt động chống lại nấm gây bệnh như Cryptococcus neoformans và C. albicans.
Nhóm chất chống nấm khác là pseudomycin sản phẩm của Pseudomonas ở thực vật (Ballio et al., 1994). Pseudomycin hiện diện nhóm lipopeptid, chứa nhiều amino acid không thay thế L-chlorothreonine, L-hydroxy aspartic acid, D và L-diaminobutryic acid. Chúng hoạt động chống lại nấm gây bệnh người và thực vật như C. albicans, C. neoformans và các loại nấm gây bệnh thực vật bao gồm Ceratocystis ulmi và Mycosphaerella fijiensis gây bệnh ở chuối.
Pseudomycin có hiệu quả trong việc chống nấm Ascomycetes, người ta sử dụng chúng trong nông nghiệp.
Vi khuẩn nội sinh có khả năng làm yếu đi hay ngăn cản tác hại của vi sinh vật gây hại, tăng cường tính kháng bệnh đối với cây trồng. Nhiều thí nghiệm đã chứng minh vai trò của vi khuẩn nội sinh trong việc ngăn chặn sự tác hại của nấm Fusarium oxysporum f.sp vasinfectum trên bông vải (Chen et al., 1995), nấm Fusarium oxysporum f.sp trên cây đậu (Benhamou et al., 1996), … chất kháng sinh được tìm thấy trên vi khuẩn nội sinh phân lập từ khoai tây chống nấm Fusarium sambucinum, F. avenaceum và từ bắp chống nấm F. moniliformes.
Theo Mukhopadhyay et al., (1996), khi phân lập vi khuẩn nội sinh trong hạt lúa chúng có khả năng kháng nấm rất mạnh, chống lại hoạt động của nấm Rhizoctonia solani, Pythium myriotylum, Gaeumanomyces và Meloidogyne graminicola. Vi khuẩn Bacillus megaterium có khả năng kháng nấm mạnh chống lại Meloidogyne graminicola. Burkholderia sp. và B. glumae giúp cho cây lúa kháng lại R. solani.
Dòng vi khuẩn Bacillus subtilis EDR4 nội sinh trong rễ lúa mì đã tạo ra một loại protein E2 có tính kháng nấm mạnh chống lại nấm F. graminearum, Macrophoma kuwatsukai, R. cerealis, F. oxysporum f. sp vasinfectum, Botrytis cinerea và G. graminis (Liu et al., 2010)
Vi khuẩn Bacillus licheniformis và Bacillus pumilus nội sinh trong rễ cây Platycodon grandiflorum có khả năng kháng nấm rất mạnh chống lại nấm Phytophthora capsici, F. oxysporum, R. solani và Pythium ultimum (Asraful et al., 2010).
Vi khuẩn nội sinh thực vật còn giúp cho cây chống lại các tác nhân vô sinh gây bất lợi cho thực vật như tăng khả năng chịu hạn, chịu mặn (Chuansheng và Barry, 2010). Đồng thời vi khuẩn nội sinh còn tham gia oxy hóa Fe (II) và giảm lượng Fe (II) gây độc cho cây. Satapute et al., (2012) đã phân lập được loài Bacillus subtilis có khả năng cố định đạm và chịu được độ mặn rất cao với nồng độ muối từ 10 - 15%.
Tác dụng của vi khuẩn nội sinh không chỉ làm tăng năng suất và chất lượng sản phẩm nông nghiệp mà còn góp phần vào việc bảo vệ môi trường.
Với khả năng cố định đạm sinh học, hòa tan lân khó tan đã làm giảm một lượng đáng kể phân bón hóa học. Vì vậy chúng có tác dụng bảo vệ nguồn đất mặt, bảo vệ nguồn chất hữu cơ trong đất làm giảm sự ô nhiễm môi trường đất và nước. Ngoài ra, vi khuẩn nội sinh còn có khả phân hủy sinh học, chúng có thể chuyển hóa các chất độc hại trong môi trường, thuốc trừ sâu, diệt cỏ làm giảm sự ô nhiễm môi trường đất. Burkholderia cepacia G4 có khả năng tồn tại trong môi trường có hàm lượng toluen cao vì chúng co khả năng chuyển hóa toluen (Barac et al., 2004).
Siciliano et al., (2001) nhận thấy rằng cây trồng phát triển tốt trong đất nhiễm hóa chất độc. Những cánh đồng nhiễm nitro-acromatics vi sinh vật nội sinh trong cây trồng tại đây có khả năng phân hủy nitro-acromatics. Những dòng vi khuẩn cộng sinh thực vật như Methylbacterium phân lập từ cây Polar cũng có khả năng phân hủy nitro-acromatics như 2,4,6-trinitro-toluene.
Germaine et al., (2006) bổ sung vi khuẩn Pseudomonas vào cây đậu vi khuẩn này có khả năng phân hủy thuốc diệt cỏ 2,4-D.
Sự phát hiện những dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy sinh học giúp chúng ta có thể sử dụng trực tiếp chúng như các chế phẩm sinh học phân hủy độc chất hay chuyển gen có khả năng phân hủy độc chất vào vi khuẩn khác để xử lý môi trường.
Với các đặc tính tốt của vi khuẩn nội sinh, chúng có vai trò quan trọng trong ứng dụng sản xuất nông nghiệp và bảo vệ môi trường.