CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.5. Khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh cây lúa
* Định lượng đạm
Vi khuẩn có khả năng cố định đạm có thể phát triển tốt trên môi trường Burk không đạm. Cấy chuyển tất cả dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa lên môi trường Burk đặc không đạm và đưa vào tủ ủ ở 30oC, theo dõi sự phát triển của vi khuẩn từ 1 - 2 ngày. Dòng vi khuẩn nào có khả năng phát triển trên môi trường Burk không đạm thì có khả năng cố định đạm. Sau đó, cấy chuyển những dòng vi khuẩn phát triển mạnh sang môi trường Burk lỏng không đạm để khảo sát khả năng cố định đạm.
+ Chuẩn bị vi khuẩn gốc
Dùng que cấy lấy một phần sinh khối của vi khuẩn đã được phân lập và tách ròng lần lượt cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 5 ml môi trường lỏng LGI, NFb và RMR (tương ứng từ các môi trường nuôi cấy đặc), ủ trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút, nhiệt độ 30oC trong 2 ngày mật số đạt 108 tế bào/ml.
Mật số tế bào được đếm bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt (Hoben và Somasegaran, 1982) (Phụ lục 3.2).
+ Chuẩn bị mẫu
Cho 1 ml các dịch vi khuẩn trên vào các ống falcon chứa 20 ml môi trường Burk lỏng không đạm đã được khử trùng trong autoclave và nuôi trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút, nhiệt độ 30oC. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Lấy 1 ml mẫu được nuôi ở thời điểm 2, 4, 6 và 8 ngày để xác định hàm lượng đạm tổng hợp.
0 1 2 3 4 5
ĐC PHL87 SHL70 PHL103
+ Định lượng đạm được tổng hợp
+ Xây dựng đường chuẩn NH4+: gồm 6 ống nghiệm được đánh số theo thứ tự 0-1-2-3-4-5 với ống 0 là ống đối chứng âm, lần lượt thêm các thành phần vào mỗi ống nghiệm như Bảng 3.8.
Bảng 3.8. Thành phần của dãy đường chuẩn NH4+
Ống nghiệm
Hóa chất 0 1 2 3 4 5
Nước cất (ml) 5 4 3 2 1 0
Dung dich NH4+ chuẩn (ml) 0 1 2 3 4 5
Phenol- Sodium nitroprusside (ml) 2 2 2 2 2 2
Dung dịch EDTA (ml) 1 1 1 1 1 1
Dung dịch Sodium hypochloride (ml) 4 4 4 4 4 4
Hàm lượng NH4+/ống (mg/l) 0 1 2 3 4 5
- Tiến hành khuấy các ống nghiệm trên máy vortex và để ổn định ở nhiệt độ 30oC khoảng 15 - 20 phút để phản ứng tạo màu xảy ra.
Đường chuẩn
Hình 3.3. Phản ứng màu của các ống nghiệm xây dựng đường chuẩn và mẫu đo NH4+ với thuốc thử
+ Chuẩn bị mẫu đo: mẫu được hút vào các eppendorf, sau đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút. Chuẩn bị 1 ống nghiệm cho mỗi mẫu, mỗi mẫu lặp lại 3 lần và lần lượt cho vào các thành phần sau: 4 ml nước cất, 1 ml dịch mẫu, 2 ml dung dịch Phenol - Sodium nitroprusside, 1 ml EDTA, 4 ml dung dịch Sodium hypochloride. Tiến hành khuấy các ống nghiệm trên máy vortex và để ổn định khoảng 15 - 20 phút.
+ Tiến hành đo hàm lượng NH4+ bằng phương pháp so màu ở bước sóng 640 nm (OD640 nm) trên quang phổ kế (Page et al., 1982).
Đo giá trị OD của 6 ống nghiệm đường chuẩn để xây dựng đường chuẩn, sau đó tiến hành đo giá trị OD của các mẫu thí nghiệm. Sử dụng giá trị đo OD của ống 0 (không có NH +, không có màu xanh) làm mẫu đối chứng âm, blank
đưa giá trị OD về 0 và tiến hành đo giá trị OD của 5 ống còn lại của đường chuẩn. Màu xanh đậm dần tương ứng với giá trị OD tăng dần.
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để nhập số liệu và vẽ đồ thị xác định phương trình tương quan tuyến tính của NH4+ và OD 640 nm:
Y = aX + b, trong đú X là nồng độ của mẫu đo (àg/ml), Y là mật độ quang (OD640 nm). Dựa vào phương trình đường chuẩn và giá trị OD640 nm của mẫu để tính hàm lượng đạm NH4+ tương đương lượng NH4+ có trong mẫu theo công thức: X = (Y– b)/a. Đường chuẩn chỉ sử dụng được khi R2 có giá trị từ 0,98 đến 1.
* Định lượng khả năng hòa tan lân khó tan
Các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được có khả năng tổng hợp NH4+
được cấy trên môi trường chứa lân khó tan (NBRIP) đặc và ủ ở nhiệt độ 30oC, trong 1 - 2 ngày, dòng nào phát triển được trên môi trường NBRIP thì có khả năng hòa tan lân khó tan. Sau đó chọn dòng phát triển mạnh trên môi trường NBRIP và tiến hành khảo sát khả năng hòa tan lân trên môi trường NBRIP lỏng.
+ Chuẩn bị vi khuẩn gốc: tương tự như thí nghiệm định lượng đạm.
+ Chuẩn bị mẫu: cho 1ml dịch vi khuẩn có mật số 108 tế bào/ml vào các ống falcon 50 ml chứa 20 ml môi trường NBRIP lỏng đã được khử trùng autoclave 121oC trong 20 phút. Mỗi dòng vi khuẩn lặp lại 3 lần, với đối chứng không có vi khuẩn. Các ống falcon được ủ trên máy lắc 120 vòng/phút, ở nhiệt độ 30oC. Mẫu thu tại thời điểm 5, 10, 15 và 20 ngày sau khi bổ sung vi khuẩn.
Ly tâm mẫu 1200 vòng/phút, rồi hút 1 ml phần dịch bên trên và tiến hành đo lượng P2O5 bằng phương pháp so màu ở bước sóng 880 nm trên quang phổ kế (Murphy và Riley, 1962).
+ Xây dựng đường chuẩn P2O5: gồm 6 ống nghiệm được đánh số theo thứ tự 0-1-2-3-4-5 với ống 0 là ống đối chứng âm, lần lượt thêm các thành phần vào mỗi ống nghiệm như Bảng 3.9.
Bảng 3.9. Thành phần của dãy đường chuẩn P2O5
Ống nghiệm
Hóa chất 0 1 2 3 4 5
Nước cất (ml) 10 10 10 10 10 10
Dung dich lân (P2O5) chuẩn (ml) 0 1 2 3 4 5
Dung dịch B (ml) 8 8 8 8 8 8
Nước cất (ml) 7 6 5 4 3 2
Hàm lượng P2O5/ống (mg/l) 0 10 20 30 40 50
0 1 2 3 4 5
ĐC TAL4 TAL1 DHL136
Tiến hành khuấy các ống nghiệm với vortex và để ổn định ở nhiệt độ 30oC khoảng 15 - 20 phút để phản ứng tạo màu xảy ra.
Đường chuẩn
Hình 3.4. Phản ứng màu của các ống nghiệm xây dựng đường chuẩn và mẫu đo P2O5
+ Chuẩn bị mẫu: mẫu được hút vào các eppendorf, sau đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút. Chuẩn bị 1 ống nghiệm cho mỗi mẫu, mỗi mẫu lặp lại 3 lần và lần lượt cho vào các thành phần sau: 10 ml nước cất, 1 ml dịch mẫu, 8 ml dung dịch B và 6 ml nước cất.
Tiến hành khuấy các ống nghiệm với vortex và để ổn định khoảng 15 - 20 phút ở nhiệt độ 30oC.
+ Tiến hành đo hàm lượng P (P2O5) bằng phương pháp so màu ở bước sóng 880 nm (OD880nm). Dựa vào phương trình đường chuẩn có dạng:
Y = aX + b để tính hàm lượng lân tương đương lượng P (P2O5).
Nếu hàm lượng lân trong mẫu sau khi ly tâm cao hơn so với đường chuẩn lân sẽ tiến hành pha loãng mẫu để đo hàm lượng lân.
* Định lượng IAA
Cho 300 àl dịch vi khuẩn gốc (mật số 108 tế bào/ml) vào cỏc eppendorf 2 ml chứa 1,5 ml môi trường LGI, Nfb (không bổ sung Bromothymol blue) hoặc môi trường RMR (tùy theo môi trường mà vi khuẩn được phân lập) đã được khử trùng trong autoclave 121oC trong 20 phút, có bổ sung 100 mg/l tryptophan. Mỗi dòng vi khuẩn lặp lại 3 lần, mẫu đối chứng không có vi khuẩn. Các eppendorf được ủ trong tối và ở nhiệt độ 30oC. Mẫu được thu tại thời điểm 2, 4, 6 và 8 ngày sau khi bổ sung vi khuẩn. Ly tâm mẫu 12000 vòng/phút và hút 1 ml dịch phần bên trên định lượng IAA bằng thuốc thử Salkowsky R2 (4,5 g FeCl3 trong 10,8 M H2S04) (Glickmann và Desseaux, 1995) và đo bằng phương pháp so màu ở bước sóng 530 nm (Patten và Glick, 2002).
+ Phương pháp đo IAA
Xây dựng đường chuẩn IAA: gồm 6 ống nghiệm được đánh số theo thứ tự 0-1-2-3-4-5 với ống 0 là ống đối chứng âm, lần lượt thêm các thành phần
0 1 2 3 4 5
ĐC TAL30 TALa14 SHL70 PHL87
Bảng 3.10. Thành phần của dãy đường chuẩn IAA Ống nghiệm
Hóa chất 0 1 2 3 4 5
Nước cất (ml) 1 1 1 1 1 1
Dung dịch thuốc thử Salkowsky (ml) 2 2 2 2 2 2
Dung dịch IAA chuẩn (ml) 0 1 2 3 4 5
Hàm lượng IAA/ống (àg/ml) 0 5 10 15 20 25
Đường chuẩn
Hình 3.5. Phản ứng màu của các ống nghiệm xây dựng đường chuẩn và mẫu đo IAA
Tiến hành khuấy các ống nghiệm với vortex và để ổn định ở nhiệt độ 30oC, trong tối khoảng 15 - 20 phút để phản ứng tạo màu xảy ra hoàn toàn.
+ Chuẩn bị mẫu: các eppendorf được ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút. Chuẩn bị 1 ống nghiệm cho mỗi mẫu và lần lượt cho vào các thành phần sau: 1 ml nước cất, 2 ml dung dịch thuốc thử Salkowsky và 1 ml dịch mẫu.
Tiến hành khuấy các ống nghiệm và để ổn định ở nhiệt độ 30oC, trong tối. Sau đó đo hàm lượng IAA bằng phương pháp so màu ở bước sóng 530 nm (OD530nm) trên quang phổ kế. Dựa vào phương trình đường chuẩn có dạng:
Y = aX + b để tính IAA.
Tất cả thí nghiệm được thực hiện trong tối.