Trong số 556 dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được thì có 533 dòng vi khuẩn (177 dòng vi khuẩn thuộc môi trường LGI, 184 dòng thuộc môi trường Nfb và 172 dòng vi khuẩn thuộc môi trường RMR) phát triển mạnh trên môi trường Burk đặc không đạm, còn lại 18 dòng vi khuẩn phát triển yếu và 5
900 bp
dòng vi khuẩn phát triển rất yếu dường như không xuất hiện khuẩn lạc trên môi trường.
Tất cả 533 dòng vi khuẩn phát triển mạnh trên môi trường Burk đặc không đạm được nuôi cấy trên môi trường Burk lỏng không đạm và khảo sát hàm lượng NH4+ tạo ra sau 2, 4, 6 và 8 ngày (Hình 4.6).
Hình 4.6. Khuẩn lạc dòng vi khuẩn TAL4 sau 2 ngày cấy trên môi trường Burk không đạm
4.3.1. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn Kết quả khảo sát ở Hình 4.7 hàm lượng NH4+ tổng hợp được sau 2, 4, 6 và 8 ngày của 533 dòng vi khuẩn nuôi trên môi trường Burk lỏng không đạm cho thấy, tất cả các dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp NH4+. Ở ngày thứ 2 khảo sát chỉ có 59/533 dòng vi khuẩn có hàm lượng NH4+ đo được > 2,99 mg/l, có 139/533 dòng vi khuẩn có hàm lượng NH4+ dao động từ 2,00 - 2,99 mg/l, có đến 239/533 dòng vi khuẩn có hàm lượng NH4+ dao động từ 1,00 - 1,99 mg/l và còn lại 96/533 dòng vi khuẩn có hàm lượng NH4+ < 1mg/l. Tiếp tục nuôi vi khuẩn đến ngày thứ 4 và đo hàm lượng NH4+, đa số các dòng vi khuẩn có hàm lượng NH4+ tăng lên và nhiều dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp NH4+ khá cao, có đến 174/533 dòng vi khuẩn có hàm lượng NH4+ > 2,99 mg/l trong khi đó ở ngày thứ 2 chỉ có 59/533 dòng, 248/533 dòng vi khuẩn có hàm lượng NH4+ dao động từ 2,00 - 2,99 mg/l, 100/533 dòng vi khuẩn có hàm lượng NH4+ dao động từ 1,00 - 1,99 mg/l và còn lại 11/533 dòng vi khuẩn có hàm lượng NH4+ < 1mg/l. Sau 6 ngày, phần lớn khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn đều giảm, có 110/533 dòng vi khuẩn có hàm lượng NH4+ >
2,99 mg/l, 225/533 dòng vi khuẩn có hàm lượng NH4+ dao động từ 2,00 - 2,99 mg/l, có 182/533 dòng có hàm lượng NH4+ dao động từ 1,00 - 1,99 mg/l và còn lại 16/533 dòng có hàm lượng NH4+ < 1mg/l. Đến ngày thứ 8 nhiều dòng vi khuẩn tiếp tục giảm hàm lượng NH4+ tổng hợp được, chỉ còn lại 32/533 dòng vi khuẩn có hàm lượng NH4+ > 2,99 mg/l, 99/533 dòng vi khuẩn có hàm lượng NH4+ dao động từ 2,00 - 2,99 mg/l, có đến 320/533 dòng vi khuẩn có hàm
lượng NH4+ dao động từ 1,00 - 1,99 mg/l và có 82/533 dòng vi khuẩn có hàm lượng NH4+ < 1mg/l.
96
11 16
82 239
100
182
320
139
248
225
99 59
174
110
32 0
50 100 150 200 250 300 350
Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Ngày 8
Số dòng 0 - 0.99
1.00 - 1.99 2.00 - 2.99
> 2.99
Hình 4.7. Sự biến thiên hàm lượng NH4+ của 533 dòng vi khuẩn theo thời gian
Dựa vào kết quả phân tích hàm lượng NH4+ tổng hợp được qua 4 thời điểm khảo sát ngày 2, 4, 6 và ngày 8, cho thấy hàm lượng NH4+ biến động theo thời gian với 8 trường hợp (Phụ lục 4.1):
- Trường hợp thứ nhất có 39/533 dòng vi khuẩn có hàm lượng NH4+
trung bình tổng hợp được đạt đỉnh cao là ngày thứ 2 sau đó giảm vào ngày thứ 4, 6 và ngày thứ 8.
- Trường hợp thứ hai ghi nhận được 12/533 dòng vi khuẩn có hàm lượng NH4+ trung bình tổng hợp được đạt đỉnh cao là ngày thứ 2 sau đó giảm dần qua 4, tăng ngày 6 và giảm ngày 8.
- Trường hợp thứ ba chỉ có 3/533 dòng vi khuẩn có hàm lượng NH4+
trung bình tổng hợp được đỉnh cao là ngày thứ 2 sau đó giảm vào ngày thứ 4, tăng vào ngày 6 và tăng ngày thứ 8.
- Trường hợp thứ tư có 5/533 dòng vi khuẩn có hàm lượng NH4+ trung bình tổng hợp được đỉnh cao là ngày thứ 2 sau đó giảm vào ngày thứ 4, ngày 6 và tăng ngày thứ 8.
- Trường hợp thứ năm có 8/533 dòng vi khuẩn có hàm lượng NH4+ trung bình tổng hợp được tăng từ ngày 2 đến ngày 8.
- Trường hợp thứ sáu ghi nhận được 137/533 dòng vi khuẩn có hàm lượng NH4+ trung bình tổng hợp được tăng từ ngày 2 đến ngày 6 và giảm ngày thứ 8.
- Trường hợp thứ bảy có đến 305/533 dòng vi khuẩn có hàm lượng NH4+
trung bình tổng hợp được tăng từ ngày 2 đến ngày 4 và giảm ngày thứ 6, 8.
Giá trị NH4+ (mg/l)
- Trường hợp thứ tám có 24/533 dòng vi khuẩn có hàm lượng NH4+ trung bình tổng hợp được tăng từ ngày 2 đến ngày 4, giảm ngày 6 và tăng lại ngày thứ 8.
Kết quả của sự biến thiên này là do tốc độ phát triển của các dòng vi khuẩn không giống nhau, những dòng vi khuẩn có tốc độ phát triển nhanh nên chỉ sau 2 ngày nuôi cấy hàm lượng NH4+ đạt cao nhất như dòng: THL103 (7,26 mg/l), TANa8 (6,88 mg/l), THL105 (6,87 mg/l), TAL22 (6,68 mg/l) và SHL70 (6,59 mg/l) (Phụ lục 4.1). Đa số các dòng vi khuẩn phân lập được 305/533 dòng có lượng hàm lượng NH4+ đạt mức cao nhất vào ngày thứ 4. Có 137/533 dòng vi khuẩn phát triển chậm hơn hàm lượng NH4+ đạt mức cao nhất vào ngày thứ 6 và một số dòng vi khuẩn phát triển rất chậm thì hàm lượng NH4+ tăng theo thời gian. Ngoài ra một số dòng vi khuẩn có hàm lượng NH4+
được tạo ra cao nhất vào ngày 2 sau đó giảm vào ngày 4 và tăng lại ngày 6 hoặc ngày 8. Những dòng vi khuẩn này có lẽ rất nhạy cảm với hàm lượng NH4+ hình thành. Theo kết quả nghiên cứu của Van và Sloger (1981) trong quá trình tổng hợp NH4+, sự hoạt động của enzyme nitrogenase bị tác động ức chế bởi hàm lượng NH4+. Khi hàm lượng NH4+ tăng sẽ ức chế vi khuẩn tổng hợp NH4+ và khi vi khuẩn sử dụng lượng NH4+ cho nhu cầu phát triển thì hàm lượng NH4+ trong môi trường giảm đi điều này lại kích thích vi khuẩn tổng hợp NH4+ trở lại. Ngoài ra, quá trình tổng hợp NH4+ của vi khuẩn còn bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác như: nhiệt độ, pH, ... Nhóm này nếu ứng dụng trong sản xuất lúa sẽ không có hiệu quả cao khi môi trường trồng lúa có nhiều phân đạm sẽ bị ức chế sớm.
Trong số 533 dòng vi khuẩn khảo sát đều có khả năng tổng hợp NH4+, một số dòng có khả năng tổng hợp NH4+ khá cao sau 2 ngày nuôi cấy và hàm lượng NH4+ này khá ổn định theo thời gian như dòng THL103 hàm lượng NH4+ tạo ra cao nhất vào ngày thứ 2 (7,26 mg/l), THL105 (6,87 mg/l) và SHL70 (6,59 mg/l), … Đây là những dòng vi khuẩn rất có tiềm năng trong ứng dụng trồng lúa, chúng có khả năng cố định đạm tốt ngay cả trong điều kiện thực tế ruộng lúa mà bà con nông dân bón nhiều đạm. So với kết quả phân lập vi khuẩn Burkholderia nội sinh cây khóm do Trần Thanh Phong và Cao Ngọc Điệp (2012) phân lập trên môi trường LGI có hàm lượng NH4+ tổng hợp được cao nhất vào ngày thứ 2 chỉ là 0,12 mg/l.
4.3.2. Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn
Tất cả 533 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp NH4+ được cấy trên môi trường NBRIP đặc, có 457 dòng vi khuẩn (149 dòng vi khuẩn thuộc môi trường LGI, 162 dòng thuộc môi trường Nfb và 146 dòng vi khuẩn thuộc môi
trường RMR) phát triển mạnh trên môi trường NBRIP đặc, còn lại 35 dòng vi khuẩn phát triển yếu và 41 dòng vi khuẩn phát triển rất yếu dường như không xuất hiện khuẩn lạc trên môi trường. Tất cả 457 dòng vi khuẩn phát triển mạnh trên môi trường NBRIP đặc được nuôi cấy trên môi trường NBRIP lỏng và khảo sát hàm lượng P2O5 tạo ra sau 5, 10, 15 và 20 ngày. Kết quả khảo sát ở Hình 4.8 cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn này đều có khả năng hòa tan lân khó tan.
- Sau 5 ngày nuôi cấy tất cả 457 dòng vi khuẩn đều có khả năng hòa tan lân khó tan, chỉ có 25/457 dòng có hàm lượng P2O5 > 150 mg/l, 38/457 dòng có hàm lượng P2O5dao động từ 100 - 150 mg/l, 139/457 dòng có hàm lượng P2O5
dao động từ 50 - 99 mg/l và có đến 255/457 dòng với hàm lượng P2O5dao động 5 - 50 mg/l.
- Sau 10 ngày nuôi cấy, nhiều dòng vi khuẩn đều có hàm lượng P2O5 tăng lên, có đến 63/457 dòng đạt hàm lượng P2O5 > 150 mg/l, trong khi đó ở ngày thứ 5 chỉ có 25/457 dòng.
- Sau 15 ngày nuôi cấy, có 51/457 dòng vi khuẩn có hàm lượng P2O5 >
150 mg/l.
- Đến ngày thứ 20 nhiều dòng vi khuẩn có hàm lượng P2O5 tạo ra bị giảm đi, có 16/457 dòng có hàm lượng P2O5 > 150 mg/l trong khi đó ở ngày thứ 10 có đến 63/457 dòng.
Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan của 457 dòng vi khuẩn trong thời gian 5, 10, 15 và 20 ngày nuôi cấy có sự thay đổi theo 5 hướng khác nhau (Phụ lục 4.1).
- Chiều hướng thứ nhất ghi nhận được 18/457 dòng vi khuẩn có hàm lượng P2O5 tạo ra đạt mức cao nhất vào ngày thứ 5 và giảm dần theo thời gian.
- Chiều hướng thứ hai có đến 195/457 dòng vi khuẩn có hàm lượng P2O5
tạo ra tăng từ ngày 5 đến ngày 10 và bắt đầu giảm dần từ ngày 15 đến ngày 20.
- Chiều hướng thứ ba ghi nhận được 180/457 dòng vi khuẩn có hàm lượng P2O5 tạo ra tăng từ ngày 5 đến ngày 15 và giảm vào ngày thứ 20.
- Chiều hướng thứ tư chỉ có 12/457 dòng vi khuẩn có hàm lượng P2O5 tạo ra tăng từ ngày 5 đến ngày 10, giảm vào ngày 15 và không đổi vào ngày 20.
- Chiều hướng thứ năm ghi nhận được 52/457 dòng vi khuẩn có hàm lượng P2O5 tạo ra tăng dần theo thời gian từ ngày 5 đến ngày 20.
Tương tự như kết quả khảo sát sự biến thiên của việc tổng hợp NH4+ thì tốc độ biến thiên của việc hòa tan lân khó tan cũng phụ thuộc vào tốc độ phát triển của vi sinh vật.
255
129 117
198
139
185 195 189
38
80
94
54 25
63
51
16
0 50 100 150 200 250 300
Ngày 5 Ngày 10 Ngày 15 Ngày 20
Số dòng 5.0-50
50 - 99 100 - 150
> 150
Hình 4.8. Sự biến thiên hàm lượng P2O5của 457 dòng vi khuẩn theo thời gian * Nhìn chung tất cả 457 dòng vi khuẩn được khảo sát đều có khả năng hòa tan lân khó tan, hàm lượng P2O5 được tạo ra thay đổi theo thời gian, nhiều dòng vi khuẩn có hàm lượng P2O5 tạo ra đạt mức cao nhất vào ngày thứ 10 hoặc 15. Một số dòng có khả năng hòa tan lân khó tan rất cao sau 10 ngày nuôi cấy như dòng TAL1 (634,11 mg/l), dòng TAL4 (454,32 mg/l), … (Phụ lục 4.1). Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Kumar et al., (2008) khi phân lập Enterobacter sp. trong môi trường pH = 7 có khả năng hòa tan lân khó tan 229 mg/l, theo Chen et al., (2006) tùy thuộc vào môi trường pH vi khuẩn hòa tan lân khó tan dao động từ 31,5 mg/l đến 898 mg/l và theo báo cáo của Nguyễn Thị Thu Hà và Cao Ngọc Điệp (2008) khi phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây cỏ trên môi trường LGI khả năng hòa tan lân tốt nhất với lượng lân hòa tan là 283,33 mg/l sau 10 ngày nuôi.
4.3.3. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn Ngoài khả năng hòa tan lân khó tan, 457 dòng vi khuẩn tiếp tục được khảo sát khả năng tổng hợp IAA.
Kết quả khảo sát ở Hình 4.9 tại 4 thời điểm là 2, 4, 6 và 8 ngày nuôi, cho thấy tất cả 457 dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp IAA. Ở ngày thứ 2 khảo sát nhiều dòng có khả năng tổng hợp IAA khá cao như SHL69 (33,99 àg/ml), PHL103 (31,47 àg/ml), SHL63 (31,33 àg/ml), TAMa9 (29,19 àg/ml), TAN11 (25,69 àg/ml) (Phụ lục 4.1). Cú 24/457 dũng vi khuẩn đạt hàm lượng IAA > 20 àg/ml, 182/457 dũng vi khuẩn cú hàm lượng IAA dao động từ 10 - 20 àg/ml, 185/457 dũng vi khuẩn cú hàm lượng IAA dao động từ 5,0 - 9,9 àg/ml và còn lại 66/457 dòng vi khuẩn có hàm lượng IAA dao động từ 0,15 - 4,90 àg/ml. Ngày thứ 4 nhiều dũng vi khuẩn đều cú hàm lượng IAA tăng cú đến
Giá trị P2O5 (mg/l)
71/457 dũng vi khuẩn đạt hàm lượng IAA > 20 àg/ml, trong khi đú ở ngày thứ 2 chỉ có 24/457 dòng. Tiếp tục khảo sát vào ngày thứ 6 có 25/457 dòng vi khuẩn đạt hàm lượng IAA > 20 àg/ml, cú đến 284/457 dũng vi khuẩn cú hàm lượng IAA dao động từ 10 - 20 àg/ml, 121/457 dũng vi khuẩn cú hàm lượng IAA dao động từ 5,0 - 9,9 àg/ml và 27/457 dũng vi khuẩn cú hàm lượng IAA dao động từ 0,5 - 4,90 àg/ml. Đến ngày thứ 8 nhiều dũng vi khuẩn đó giảm hàm lượng IAA tổng hợp được, chỉ có 4/457 dòng vi khuẩn đạt hàm lượng IAA > 20 àg/ml, 105/457 dũng vi khuẩn cú hàm lượng IAA dao động từ 10 - 20 àg/ml, cú đến 235/457 dũng vi khuẩn cú hàm lượng IAA dao động từ 5,0 - 9,9 àg/ml và 113/457 dũng vi khuẩn cú hàm lượng IAA dao động từ 0,15 - 4,90 àg/ml (Hỡnh 4.9).
66
18 27
113 185
112 121
235
182
256
284
105
24
71
25
4 0
50 100 150 200 250 300
Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Ngày 8
Số dòng 0.15 - 4.9
5.0 - 9.9 10.0 - 20.0
> 20.0
Hình 4.9. Sự biến thiên hàm lượng IAA của 457 dòng vi khuẩn theo thời gian Hàm lượng IAA được tổng hợp qua 4 thời điểm khảo sát đã biên thiên theo 4 chiều hướng khác nhau: có 80/457 dòng vi khuẩn với hàm lượng IAA tạo ra đạt mức cao nhất vào ngày thứ 2 và giảm dần từ ngày 4 đến ngày 8, 235/457 dòng vi khuẩn có hàm lượng IAA tạo ra tăng từ ngày 2 đến ngày 4 và bắt đầu giảm dần từ ngày 6 đến ngày thứ 8, có 123/457 dòng vi khuẩn với hàm lượng IAA tạo ra tăng từ ngày 2 đến ngày 6 và giảm vào ngày 8 và chỉ có 19/457 dòng vi khuẩn có hàm lượng IAA tạo ra tăng dần theo thời gian từ ngày 2 đến ngày 8.
* Nhìn chung hàm lượng IAA tạo ra của các dòng vi khuẩn được phân lập thay đổi theo thời gian, chiều hướng thứ 2 chiếm ưu thế với sự hiện diện của nhiều dòng vi khuẩn. Các dòng vi khuẩn phân lập ngoài khả năng tổng hợp NH4+ và hòa tan lân khó tan thì có khả năng tổng hợp IAA, nhiều dòng có khả năng tổng hợp IAA khá cao sau 4 ngày nuôi cấy như dòng SHL63 (38,75 àg/ml), PHL86 (37,77 àg/ml), … (Phụ lục 4.1). Kết quả khảo sỏt này tương tự với các kết quả nghiên cứu trước đây. Sự tổng hợp IAA của vi khuẩn
àg/ml IAA
Azospirillum brasilense ớt hơn 2 àg/ml trong mụi trường khụng đạm nhưng trong mụi trường cú NH4+ và cú bổ sung tryptophan đạt được 24 àg/ml (Tien et al., 1979). Nhiều loài vi khuẩn như Enterobacter cloacea sử dụng L- tryptophan là tiền chất để tổng hợp IAA (Koga et al., 1991). Malik et al., (1997) nhận thấy Pseudomonas có khả năng tổng hợp IAA khá cao (35 àg/ml). Ahmad et al., (2005) đó phõn lập 21 dũng vi khuẩn (Azotobacter sp., Pseudomonas sp.) mức độ tạo IAA của các dòng thấp khi không bổ sung tryptophan và có 7 dòng Azotobacter có khả năng tổng hợp IAA cao (32,8 àg/ml) và Pseudomonas sp. cú khả năng tổng hợp IAA cao trong mụi trường khụng cú tryptophan (41,0 - 53,2 àg/ml). Hàm lượng IAA tạo ra phụ thuộc vào loài, dòng vi khuẩn, điều kiện nuôi cấy như pH, nồng độ oxy và giai đoạn phát triển.