4.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn
Vi khuẩn nội sinh cây lúa được phân lập từ 3 loại môi trường khác nhau:
LGI, Nfb và RMR. Mục đích của việc phân lập trên các môi trường này là tìm thấy sự đa dạng của các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa. Vì các dòng vi khuẩn khác nhau có khả năng phát triển và cố định đạm trong điều kiện môi trường carbon và pH khác nhau (Bhavanath et al., 2009).
Theo Cavalcante và Dửbereiner, (1988) khi phõn lập vi khuẩn nội sinh trên môi trường LGI đã tìm thấy chủ yếu là vi khuẩn Gluconacetobacter.
Krieg và Dửbereiner, (1984) phõn lập vi khuẩn nội sinh trờn mụi trường Nfb đã phát hiện ra các loài vi khuẩn thuộc chi Azospirillum. Theo Elbeltagy et al., (2001) vi khuẩn nội sinh được phân lập trên môi trường RMR chủ yếu là loài Pantoea agglomerans.
Tổng cộng có 593 dòng vi khuẩn phân lập được từ thân và rễ của 119 mẫu lúa thu được ở 7 huyện và thành phố Tuy Hòa trên 3 loại môi trường nuôi cấy LGI, Nfb và RMR. Trong đó, có 191 dòng phân lập trên môi trường LGI, 207 dòng phân lập trên môi trường Nfb và 195 dòng phân lập được trên môi trường RMR (Phụ lục 4.1)
Trong số 593 dòng vi khuẩn đã phân lập, số dòng vi khuẩn phân lập từ rễ là 372 dòng (131 dòng ở môi trường LGI; 123 dòng ở môi trường Nfb và 118 dòng môi trường RMR) chiếm tỷ lệ 62,73%. Số dòng phân lập từ thân là 221 dòng (60 dòng ở môi trường LGI, 84 dòng ở môi trường Nfb và 77 dòng ở môi trường RMR) chiếm tỷ lệ 37,27%. Kết quả này cho thấy vi khuẩn tập trung ở rễ nhiều hơn thân (Bảng 4.1). Điều này cũng rất phù hợp, vì nguồn gốc vi khuẩn nội sinh là tập trung và xâm nhập chủ yếu tại vùng rễ nên số lượng vi khuẩn nội sinh có ở rễ nhiều hơn thân.
Tất cả 593 dòng vi khuẩn được phân lập trên 3 loại môi trường đã được nhận diện dựa vào hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và nhuộm Gram. Trong đó có 90/593 dòng vi khuẩn được nhận diện bằng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định mối quan hệ ở cấp loài. Nếu định danh tất cả 593 dòng vi khuẩn được phân lập thì có thể có một số dòng vi khuẩn được phân lập trên 3 loại môi trường nhưng thuộc cùng 1 loài nên tổng số vi khuẩn phân lập có thể ít hơn 593 dòng. Cho dù thuộc cùng 1 loài nhưng hoạt tính sinh học của các dòng này có lẽ khác nhau.
Bảng 4.1. Các dòng vi khuẩn được phân lập từ trong cây lúa
TT Địa điểm Ký hiệu Số Dòng VK
MT LGI
Dòng VK MT Nfb
Dòng VK MT RMR lượng
mẫu
LGI NfB RMR Thân Rễ Thân Rễ Thân Rễ 1 Tuy An TA
L N M
23 14 38 26 32 14 33
2 Đông Xuân DX 12 4 10 9 10 5 11
3 Sơn Hòa SH 12 6 18 13 17 13 13
4 Phú Hòa PH 14 13 19 10 15 11 17
5 Tây Hòa TH 15 4 15 9 11 9 9
6 Sông Hinh SHI 10 5 6 4 5 4 5
7 Đông Hòa DH 18 5 14 3 15 5 10
8 Tuy Hòa PTH 15 9 11 10 18 16 20
60 131 84 123 77 118
Tổng cộng 119 191 207 195
Các dòng vi khuẩn phân bố ở rễ, thân có chung đặc tính là sinh trưởng và phát triển trong điều kiện vi hiếu khí. Khi nuôi cấy trong điều kiện môi trường bán đặc, sau 48 giờ vi khuẩn phát triển thành vòng pellicle (màu vàng nhạt trên môi trường LGI, màu trắng trên môi trường Nfb và màu trắng đục trên môi trường RMR), cách bề mặt môi trường 2 - 5 mm (Hình 4.1). Kết quả này phù hợp với báo cáo của Weber et al., (1999). Theo nghiên cứu của Perin et al., (2006) khi phân lập vi khuẩn nội sinh và nuôi trong môi trường bán lỏng sau 48 giờ thì vòng pellicle hình thành cách mặt môi trường là 4 mm và có màu hơi trắng hoặc hơi vàng, kết quả của Santos et al., (2001) là khoảng 1 - 4 mm và theo báo cáo của Nguyễn Thị Thu Hà và Cao Ngọc Điệp (2008) thì lớp màng cách mặt môi trường từ 5 - 10 mm.
Các dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường Nfb, khi tăng trưởng chúng đã biến đổi màu của bromothymol blue làm cho môi trường chuyển từ màu xanh lá cây (trung tính, pH = 6,8) sang màu xanh dương của môi trường kiềm (pH = 8,0 - 8,5) (Hình 4.1), điều này phù hợp kết quả nghiên cứu của Nguyễn Hữu Hiệp và ctv., (2005), Nguyễn Thị Thu Hà và Cao Ngọc Điệp (2008).
Vòng pellicle 1 2 3 4 5 6
LGI Nfb RMR Hình 4.1. Vòng pellicle xuất hiện trên các môi trường nuôi cấy 1, 3, 5: Môi trường không có vi khuẩn, 2,4,6: Môi trường có vi khuẩn
4.1.2. Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập
Kết quả khảo sát đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được ghi nhận ở Bảng 4.2.
Bảng 4.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn Đặc điểm
khuẩn lạc
Các loại Số
lượng
Tỷ lệ (%)
Số lượng
Tỷ lệ (%)
Số lượng
Tỷ lệ (%)
Tổng cộng
Tỷ lệ (%)
LGI Nfb RMR
Màu sắc Vàng nhạt 125 21,08 18 3,04 3 0,50 146 24,62
Vàng đậm 31 5,23 9 1,51 0 0 40 6,74
Trắng đục 20 3,37 122 20,57 98 16,53 240 40,47
Trắng trong 15 2,53 58 9,78 94 15,86 167 28,17
Hình dạng Tròn, bìa
nguyên, nhô cao 184 31,03 183 30,86 163 27,48 530 89,37 Không đều, bìa
cưa, lài 7 1,18 16 2,70 32 5,39 55 9,27
Tròn, nguyên,
lài 0 0 8 1,36 0 0 8 1,36
Đường kính
khuẩn lạc 1 - 3 mm 191 32,21 207 34,91 195 32,88 593 100
- Màu sắc khuẩn lạc: sau 24 giờ nuôi cấy trên các loại môi trường, khuẩn lạc có màu vàng nhạt, vàng đậm, trắng đục hoặc trắng trong (Hình 4.2). Màu vàng nhạt có 146/593 dòng chiếm tỷ lệ 24,62% (21,08% trên môi trường LGI, 3,04% trên môi trường Nfb và 0,5% trên môi trường RMR), vàng đậm có 40/593 chiếm tỷ lệ 6,74% (5,23% trên môi trường LGI và 1,51% trên môi trường Nfb), trắng đục có 240/593 chiếm tỷ lệ 40,47% (3,37% trên môi trường LGI, 20,57% trên môi trường Nfb và RMR chiếm tỷ lệ 16,53%) và 167 dòng có màu trắng trong chiếm tỷ lệ 28,17% (2,53% trên môi trường LGI, 9,78%
trên môi trường Nfb và 15,86% trên môi trường RMR).
- Hình dạng khuẩn lạc: dạng tròn, bìa nguyên và nhô cao chiếm ưu thế với 530/593 đạt tỷ lệ 89,37 (31,03% trên môi trường LGI, 30,86% trên Nfb và RMR đạt tỷ lệ 27,48%), có 55/593 dạng không đều, bìa cưa, lài chiếm 9,27%
(1,18% trên môi trường LGI, 2,70% trên môi trường Nfb và RMR chiếm tỷ lệ 5,39%) và 8/593 khuẩn lạc có dạng tròn, nguyên, lài chiếm tỷ lệ 1,36% trên môi trường Nfb.
- Kích thước khuẩn lạc: sau 48 giờ cấy và ủ ở nhiệt độ 30oC, đường kính của 593 khuẩn lạc dao động từ 1 - 3 mm.
- Ngoài những đặc điểm nêu trên, các khuẩn lạc có màu trắng đục hoặc trắng trong lan ra rất nhanh trên bề mặt môi trường Nfb hoặc RMR và có độ nhầy. Nét nổi bật của các khuẩn lạc trên môi trường Nfb là làm thay đổi màu của môi trường nuôi cấy từ màu xanh lá sang xanh dương đậm (Hình 4.2).
Các mô tả về đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn này phù hợp với mô tả về khuẩn lạc vi khuẩn nội sinh của Nguyễn Thị Thu Hà và Cao Ngọc Điệp (2008), tương tự với mô tả về vi khuẩn nội sinh của Nguyễn Thành Dũng (2009). Môi trường LGI
TAL22 SHL73
Đổi màu môi trường Nfb
TAN8 TAN14 TAN5
PHN91 TAN2 TAN11 Môi trường RMR
TAMa11 PHM95 TAM13
Hình 4.2. Hình dạng khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập môi trường
- Đặc điểm tế bào vi khuẩn phân lập
Khi quan sát tế bào dưới kính hiển vi quang học, nhìn chung các dòng vi khuẩn được phân lập trên 3 loại môi trường đều có dạng hình que ngắn, một số ít vi khuẩn dạng que dài và một ít vi khuẩn có dạng hình cầu (Bảng 4.3) và (Hình 4.3). Trong đó tế bào dạng que ngắn chiếm tỷ lệ 90,73% (27,49% trên môi trường LGI, 32,72% trên môi trường Nfb và 30,52% trên môi trường RMR), tế bào dạng que dài chiếm tỷ lệ 8,26% (3,88% trên môi trường LGI, 2,02% trên môi trường Nfb và 2,36% trên môi trường RMR) và chỉ có 6 tế bào dạng hình cầu chiếm tỷ lệ 1,01% trên môi trường LGI và NfB. Đa số các dòng vi khuẩn đều có khả năng chuyển động, Gram âm (93,09%) (Bảng 4.3). Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên của Mano và Morisaki (2008), Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Ái Chi (2009), hầu hết vi khuẩn nội sinh thực vật, nội sinh cây lúa thuộc các chi Azospirillum, Burkholderia, Herbaspirillum, Pantoea, … đều thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm.
Bảng 4.3. Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn Đặc điểm tế
bào vi khuẩn
Các loại Số lượng
Tỷ lệ (%)
Số lượng
Tỷ lệ (%)
Số lượng
Tỷ lệ (%)
Tổng cộng
Tỷ lệ (%)
LGI Nfb RMR
Hình dạng Que ngắn 163 27,49 194 32,72 181 30,52 538 90,73
Que dài 23 3,88 12 2,02 14 2,36 49 8,26
Hình cầu 5 0,84 1 0,17 0 0 6 1,01
Gram - 173 29,17 196 33,05 183 30,87 552 93,09
+ 18 3,04 11 1,85 12 2,02 41 6,91
Chuyển động có 191 32,21 207 34,91 195 32,88 593 100
TAMa1 TAN18
Hình 4.3. Hình tế bào vi khuẩn chụp dưới kính hiển vi điện tử (SEM) ở độ phóng đại 14.000 lần
A: Gram âm dòng SHL70 B: Gram dương dòng TAL4
Hình 4.4. Nhuộm Gram tế bào vi khuẩn và quan sát ở độ phóng đại 400 lần
(0,628x0,989 (0,432x1,284
500 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
100 bp 1500 bp
* Nhìn chung các dòng vi khuẩn phân lập được trên 3 loại môi trường LGI, Nfb và RMR có khuẩn lạc màu trắng đục, trắng trong, vàng nhạt, một số ít màu vàng đậm. Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường LGI phần lớn có màu vàng, môi trường Nfb là màu trắng đục và môi trường RMR chủ yếu là trắng đục và trắng trong. Sự khác nhau về màu sắc khuẩn lạc là tùy thuộc vào loại vi khuẩn, đặc điểm của môi trường nuôi cấy. Khuẩn lạc tròn, nguyên và nhô cao chiếm ưu thế, đường kính khuẩn lạc dao động từ 1 - 3 mm sau 48 giờ nuôi cấy. Về đặc điểm tế bào, đa số các tế bào đều có dạng que ngắn, có khả năng chuyển động và thuộc nhóm Gram âm.