Dựa vào khả năng cố định đạm trong dung dịch, kết quả đo ARA và hiệu quả tác động của vi khuẩn lên sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa, 8 dòng vi khuẩn được tuyển chọn không chỉ được định danh bằng phương pháp sinh học phân tử hiện đại mà còn tiến hành kiểm tra một số đặc tính sinh lý sinh hóa trước khi tiến hành thí nghiệm trồng lúa trong chậu và kết quả được thể hiện ở Bảng 4.11.
Kết quả khảo sát được ghi nhận ở Bảng 4.11 cho thấy tất cả 8 dòng vi khuẩn đều có khả năng chuyển động, có 4 dòng vi khuẩn thuộc nhóm Gram âm và 4 dòng vi khuẩn thuộc nhóm Gram dương.
Tất cả 8 dòng vi khuẩn được khảo sát đều phản ứng dương tính catalase với mức độ nhẹ. Điều này cho thấy 8 dòng cần ít oxy và thuộc nhóm vi hiếu khí. Điều này rất phù hợp vì các dòng vi khuẩn được phân lập thuộc nhóm vi khuẩn nội sinh.
Cả 8 dòng không sử dụng chitin. Các nguồn cacbon còn lại các dòng vi khuẩn đều sử dụng được, ngoại trừ 3 dòng vi khuẩn SHL70, PHL87 và PHL103 không sử dụng đường maltose.
Bảng 4.11. Đặc tính sinh lý sinh hóa của 8 dòng vi khuẩn tiềm năng nội sinh cây lúa Đặc tính TAL1 TAL4 TANa5 TALa14 PHL105 SHL70 PHL87 PHL103
Chuyển động + + + + + + + +
Gram - + + + + - - -
Catalase + + + + + + + +
Glucose + + + + + + + +
Sucrose +++ +++ +++ +++ +++ + + +
Manitol + + +++ +++ +++ + + +
D-Fructose + + + + + + + +
Maltose + + + + + - - -
acid Malic + + + + + + + +
Chitin - - - - - - - -
Ghi chú: (-) không phát triển, (+) phát triển yếu, (++) phát triển mạnh, (+++) phát triển rất mạnh TAL1 (Pseudomonas putida), TAL4 (Bacillus subtilis), TANa5 (Bacillus megaterium),TALa14 (Bacillus megaterium), PHL105 (Bacillus megaterium), SHL70 (Azospirillum amazonense), PHL87 (Burkholderia kururiensis), PHL103 (Burkholderia vietnamiensis) (Trích ở Bảng 4.5).
Kết quả định danh cho thấy 8 dòng vi khuẩn phân lập đều thuộc nhóm vi khuẩn nội sinh cây lúa, có các đặc tính như cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA, … đã được nghiên cứu bởi nhiều tác giả Kloepper et al., (1988), Elmerich, (2007), Mano và Morisaki, (2008).
* Đặc điểm của dòng vi khuẩn TAL1
Kết quả định danh cho thấy dòng vi khuẩn TAL1 tương đồng 99% loài Pseudomonas putida thuộc chi Pseudomonas. Vi khuẩn Pseudomonas là vi khuẩn Gram õm, hỡnh que kớch thước rộng 0,5 - 1,0 àm, dài từ 1,5 - 5,0 àm (Theo hệ thống phân loại của Bergey) và hình chụp TAL1 cho kết quả tương tự (Hình 4.16). Chi Pseudomonas không sinh bào tử, hô hấp hiếu khí hay kỵ khí, phát triển mạnh ở nhiệt độ 30 - 37oC. Nhiều loài trong chi Pseudomonas được xác định là vi khuẩn nội sinh trong cây lúa, khoai lang, bắp, bông, … (Koomnok et al., 2007).
Hình 4.16. Hình vi khuẩn TAL1 dưới kính hiển vi điện tử (SEM)
* Đặc điểm của dòng vi khuẩn TAL4, TANa5, TALa14 và PHL105
Kết quả định danh dòng TAL4 tương đồng 99% với loài Bacillus subtilis, TANa5, TALa14 và PHL105 tương đồng 99% với loài Bacillus megaterium.
Vi khuẩn Bacillus là vi khuẩn Gram dương, hình que (Hình 4.17), kích thước tế bào rộng 0,5 - 1,0 àm, dài 1,2 - 2,5 àm. Khi chụp dưới kớnh hiển vi điện tử, chi Bacillus có khả năng sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc. Kết quả nghiên cứu của Jose, et al., (2009) đã phân lập được 42 dòng vi khuẩn nội sinh từ cây bắp, trong đó có rất nhiều loài thuộc chi Bacillus như: B. subtilis, B. Pumilus, B. cereus, B. megaterium. Kết quả so sánh một số đặc tính của 4 dòng vi khuẩn phân lập được TAL4, TANa5, TALa14 và PHL105 đã có sự tương đồng với các loài B. subtilis và B. megaterium trong chi Bacillus đã được mô tả bởi Holt, (1992) và thể hiện ở Bảng 4.12 .
Dòng vi khuẩn TAL4 Dòng vi khuẩn TANa5
Dòng vi khuẩn TALa14 Dòng vi khuẩn PHL105
Hình 4.17. Hình vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử (SEM)
Bảng 4.12. Đặc tính của các loài vi khuẩn trong chi Bacillus (Holt, 1992)
Đặc tính TAL4 TANa5 TALa14 PHL105 B. subtilis B. megaterium
Gram + + + + + +
Catalase + + + + + +
Glucose + + + + + +
Sucrose + + + + + +
Manitol + + + + + +
D-Fructose + + + + + +
Maltose + + + + + +
* Đặc điểm của dòng vi khuẩn SHL70
Dòng SHL70 tương đồng 98% với loài Azospirillum amazonense. Vi khuẩn Azospirillum là vi khuẩn Gram âm, có khả năng chuyển động và có dạng que ngắn (Hình 4.18).
Hình 4.18. Hình vi khuẩn dòng SHL70 dưới kính hiển vi điện tử (SEM) So sánh một số đặc tính của loài Azospirillum amazonense với một số loài trong chi Azospirillum theo hệ thống phân loại của Bergey, theo nghiên cứu của Mehnaz et al., (2007) và Yung et al., (2008) được ghi nhận ở Bảng 4.13. Kết quả cho thấy dòng SHL70 có các đặc tính tương đồng với loài Azospirillum amazonense theo hệ thống phân loại của Bergey (James et al., 1994)
Bảng 4.13. Đặc tính của các loài vi khuẩn trong chi Azospirillum
Đặc tính SHL70 A.
amazonense
A.
brasilense
A.
halopraeferens
A.
irakense
A.
lipoferum Kớch thước tế bào àm 0,9 0,8-1,0 1,0-1,2 0,7-1,4 0,6-0,9 1,0-1,5
Nhiệt độ tối ưu 35 35 37 41 30-33 37
MT khoai tây (BMS) + + + - * +
Màu sắc KL (BMS) Trắng Trắng Hồng Hồng
Chuyển động + + + + + +
Catalase + + + - + -
Nacl 3% * - * + + -
Glucose + + - - + +
Sucrose + + - - + -
Nguồn Biotin - - - + - +
pH 5,5-6,5 5,7-6,5 6,0-7,3 6,8-8,0 5,5-8,5 5,7-6,8
Ghi chú: * (chưa xác định).
* Đặc điểm của dòng vi khuẩn PHL87 và PHL103
Dòng PHL87 có độ tương đồng 99% với Burkholderia kururiensis và PHL103 có độ tương đồng 99% với Burkholderia vietnamiensis (Bảng 4.5).
Burkholderia là vi khuẩn Gram õm, dạng que ngắn khoảng 1 àm (Hỡnh 4.19), có khả năng chuyển động (Caballero et al., 2004). Chúng sinh trưởng trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí và trong môi trường ít oxy phát triển tốt. Hai dòng vi khuẩn PHL87 và PHL103 có phản ứng catalase dương tính nhưng rất
yếu. Hai dòng vi khuẩn này nội sinh cây lúa nên nhu cầu oxy rất ít điều này phù hợp với nghiên cứu của Caballero et al., (2004).
Dòng vi khuẩn PHL87 Dòng vi khuẩn PHL103 Hình 4.19. Hình vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử (SEM)
Kết quả khảo sát một số đặc tính của 2 dòng vi khuẩn phân lập đều có khả năng phát triển trên các nguồn đường và có kết quả tương tự với các loài Burkholderia vietnamiensis và Burkholderia kururiensis trong nghiên cứu Gillis et al., (1995).
Kết hợp phương pháp nhận diện vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại và kết quả khảo sát một số đặc tính của 8 dòng vi khuẩn đã tuyển chọn được ghi nhận ở Bảng 4.14.
Bảng 4.14. Đặc điểm của 8 dòng vi khuẩn tiềm năng được tuyển chọn
Dòng Vi khuẩn
Địa điểm
phân lập Tế bào Nhuộm Gram
Hiệu quả Mối quan hệ với các loài khi so sánh trên NCBI
Số Nu
Tương đồng (%) NH4+
(mg/l)
P2O5
(mg/l)
IAA (àg/ml)
TAL1 Tuy An - 3,53 op 371,31 a 10,39 mn Pseudomonas putida
strain C-S-TSA6 853 99 TAL4 Tuy An + 3,91 j 275,44 b 12,45 j Bacillus subtilis
strain V90 830 99
TANa5 Tuy An + 4,89 g 207,24 c 17,53 d Bacillus megaterium
strain Y18-04 846 98
TALa14 Tuy An + 3,74 l 195,45 d 5,90 t Bacillus megaterium
strain p16_B11 760 99 PHL105 Phú Hòa + 6,08 b 51,11 a-d 9,09 q Bacillus megaterium
strain p19_A07 812 99
SHL70 Sơn Hòa - 5,74 c 88,31 s 8,44 r A. amazonense
strain LMG 22237 826 98 PHL87 Phú Hòa - 4,08 i 153,91 g 16,03 e Burkholderia kururiensi
strain PR1 850 99
PHL103 Phú Hòa - 6,26 a 108,76 m 16,27 e Burkholderia
vietnamiensis strain RPB3 838 99