CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.2. Khảo sát độ thuần khiết của vi khuẩn lactic
Phương pháp khảo sát độ thuần khiết của các chủng vi khuẩn lactic Lactobacilus sp. (L5), Lactobacillus sp. (L3), Lactobacillus sp. (L2N) và chủng nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1.
Hình 2.2: Sơ đồ khảo sát độ thuần khiết của vi khuẩn lactic Chủng vi
khuẩn lactic
Tăng sinh trong môi trường MRS Broth
Cấy truyền sang MRS agar
Khảo sát đặc điểm nuôi cấy của chủng vi khuẩn lactic
Quan sát hình thái khuẩn lạc
Các thử nghiệm sinh
hóa, sinh lý Sinh IAA,
Phân giải lân, Tạo Biofilm
Thích hợp tạo chế phẩm
37 0C,24 h
47
Các chủng vi khuẩn sinh acid lactic và nấm mốc có khả năng bị suy yếu hoặc nhiễm các loài vi khuẩn khác, chính vì thế cần phải được hoạt hoá, khảo sát để đánh giá sự thuần khiết.
Ba chủng vi khuẩn sinh lactic L5, L2N, L3 có khả năng kháng nấm cao, sinh acid lactic mạnh được lấy từ phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường của Trường Đại Học Công Nghệ Hồ Chí Minh.
Chủng vi khuẩn lactic được tăng sinh trong môi trường MRS Broth và ủ ở 37 °C trong 24 giờ. Sau đó, tiến hành cấy chuyển trên MRS Agar và ủ 1 ngày ở 37 °C, sau khi quan sát hình thái khuẩn lạc và khảo sát đặc điểm nuôi cấy ở hai điều kiện lắc và không lắc, đem thử nghiệm thí nghiệm sinh lý, sinh hoá, khả năng sinh IAA, phân giải P và khả năng tạo biofilm.
2.5.2.1. Nhuộm gram
Mục đích: Giúp ta phân loại được 2 nhóm lớn: Vi khuẩn Gram dương (Gram- positive) bắt màu tím và Vi khuẩn Gram âm (Gram-negative) bắt màu hồng. Ngoài ra nhuộm Gram cho phép ta quan sát rõ hình thái tế bào hơn so với soi vi khuẩn sống.
Tiến hành: Sử dụng phương pháp Hucker cải tiến
- Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí.
- Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần. Việc cố định nhằm 3 mục đích: giết chết vi khuẩn, gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính và làm vết bôi bắt màu tốt hơn vì các tế bào chết bắt màu tốt hơn các tế bào sống.
- Nhuộm bằng dung dịch Crystal violet trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
- Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
- Tẩy cồn trong 20 giây, rửa nước, thấm khô.
- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fushin trong 30 giây, rửa nước, để khô trong không khí.
48 - Soi kính: dùng vật kính dầu 100x.
Kết quả: Vi khuẩn gram dương bắt màu tím, gram âm bắt màu hồng.
2.5.2.2. Nhuộm bào tử
Mục đích: Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử (dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipid). Đầu tiên xử lý để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và acid.
Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh.
Tẩy màu tế bào chất của tế bào và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đó tế bào chất của bào tử và tế bào chất của tế bào bắt màu phân biệt. Trong đó bào tử sẽ có màu xanh và tế bào có màu hồng.
Các vi khuẩn Gram dương thu được từ bước trên được tiếp tục kiểm tra khả năng sinh bào tử. Sử dụng sinh khối vi khuẩn khi đã già để nhuộm bào tử. Từ kết quả thu được ta loại bỏ các chủng có bào tử, do LAB là vi khuẩn Gram dương không sinh bào tử.
Tiến hành: Phương pháp Schaeffer – Fulton và sử dụng dịch nuôi cấy sau 7 ngày.
- Nuôi cấy vi khuẩn ở 37oC, 5 – 7 ngày.
- Làm vết bôi và cố định tế bào trên lame như đối với nhuộm Gram.
- Nhuộm bằng dung dịch malachite green trong 10 phút, rửa nước.
- Nhuộm lại bằng dung dịch Safranine trong 30 giây, rửa nước, thấm khô.
- Soi kính: dùng vật kính dầu 100x
Kết quả: Bào tử bắt màu lục, tế bào bắt màu hồng. Chú ý: Phân biệt bào tử với các hạt dị nhiễm cũng bắt màu lục
2.5.2.3. Thử nghiệm Catalase
Mục đích: Kiểm tra khả năng phân hủy H2O2 tạo ra O2 của vi sinh vật nhờ sản sinh enzyme catalase.
49
Các chủng vi khuẩn thu được sau bước nhuộm acid được tiến hành thử nghiệm Catalase. Trong thí nghiệm này, chỉ có những chủng vi khuẩn cho catalase âm tính là có khả năng là vi khuẩn lactic.
Tiến hành:
- Chuẩn bị dung dịch H2O2 nồng độ 3-10%, nhỏ một giọt lên phiến kính.
- Dùng đầu que cấy platin lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hoá (24 giờ) trộn vào giọt H2O2 trên phiến kính.
Kết quả: Vi khuẩn có khả năng sinh enzyme catalase nếu xuất hiệt bọt khí sủi bọt mạnh và nhanh, âm tính khi không có hiện tượng xảy ra.
2.5.2.4. Thử nghiệm khả năng lên men đường
Mục đích: Kiểm tra khả năng lên men các loại đường khác nhau của vi khuẩn.
Tiến hành: Môi trường MRS Broth lần lượt thay thế đường glucose thành các loại đường (Sucrose, D-galactose, D-glucose, D-malnitol, Fructose, D(+)manose) cần kiểm tra, bổ sung Bromocresol green và có ống durham, hấp khử trùng và cấy vi khuẩn vào, ủ ở 37°C trong 24 giờ.
Kết quả: Nếu môi trường đổi màu, đục và có bọt khí bên trong ống Durham thì chủng vi khuẩn đó lên men dị hình. Đối với những ống nghiệm không có bọt khí trong ống Durham thì cần kiểm tra lại bằng cách đốt đỏ que cấy và đặt sát bề mặt môi trường, nếu thấy có bọt khí nổi lên thì chủng vi khuẩn đó cũng lên men có sinh khí yếu.
Đánh giá khả năng lên men qua mức độ đổi màu môi trường.
Môi trường màu vàng: lên men mạnh (+++) Môi trường màu xanh lá: lên men trung bình (++) Môi trường màu xanh dương nhạt: lên men yếu (+)
Môi trường màu lam đậm (không đổi màu): không lên men (-)
50 2.5.2.5. Khả năng di động
Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật trong môi trường thạch mềm 0,5 – 0,7% agar.
Vì vi khuẩn lactic không có khả năng di động, chỉ mọc theo đường cấy thẳng đứng trong ống chứa môi trường thạch mềm và không làm đục môi trường xung quanh nên trong thử nghiệm này, ta loại bỏ được các vi khuẩn di động không phải là vi khuẩn lactic, chúng sẽ mọc lan ra khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh.
Tiến hành:
- Dùng que cấy có đầu nhọn cấy vi khuẩn theo kiểu chích sâu vào môi trường thạch bán lỏng.
- Đặt ống nghiệm thẳng đứng, ủ ở nhiệt độ thích hợp và quan sát sau 1-3 ngày, có khi lâu hơn.
Kết quả: Vi khuẩn có khả năng di động khi đường cấy lan ra, vi khuẩn chỉ mọc theo vết cấy tức là chúng không có khả năng di động, một vài trường hợp do vi khuẩn sinh hơi nên thạch bị nứt.