Ba chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, Lactobacillus sp. L3, và Lactobacillus sp.
L2N được khảo sát hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, nhuộm Gram, nhuộm bào tử, thử nghiệm catalase, di động, để kiểm tra tính thuần khiết cũng như khả năng lên men lactic của các chủng.
3.1.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc:
Khuẩn lạc lactic trên môi trường MRS Agar thường có đường kính từ 2-5 mm, bờ đều, láng và lồi, mờ đục.
Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc các chủng Lactobacillus spp. trên môi trường MRS Agar
Kết quả: Khuẩn lạc các chủng Lactobacillus sp. L5, L3, L2N mờ đục, tròn đều và lồi.
71 3.1.2 Nhuộm Gram:
Các chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L3, L2N là chủng vi khuẩn Gram dương, hình que. Bước đầu tiên ta tiến hành nhuộm Gram đối với các tế bào còn non (trong khoảng 24 giờ nuôi cấy) vì khi già vi khuẩn lactic đều trở thành Gram âm.
Khi tiến hành nhuộm Gram trước tiên tiến hành nhuộm hai chủng biết trước là vi khuẩn Bacillus subtilis Gram dương và vi khuẩn E.coli Gram âm có ở phòng thí nghiệm để làm đối chứng. Sau đó tiến hành nhuộm Gram 3 chủng Lactobacillus sp.
L5, L3, L2N và dựa vào mẫu đối chứng để kết luận.
Ở bước nhuộm Gram này ta đã tăng tính an toàn cho các chủng vi khuẩn được chọn vì đã loại bỏ một số chủng vi khuẩn gây bệnh là Gram âm ví dụ như vi khuẩn E.
coli.
Hình 3.2: Kết quả nhuộm gram của các vi khuẩn: Từ trái qua phải, vi khuẩn E.coli gram âm, vi khuẩn Bacillus subtilis gram dương, vi khuẩn Lactobacillus sp. L5
Kết quả: Ba chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, Lactobacillus sp. L3, Lactobacillus sp. L2N bắt màu tím, gram dương, que ngắn.
3.1.3 Nhuộm bào tử:
Ngoài nấm mốc cũng có các vi khuẩn có khả năng sinh bào tử. Sự hình thành bào tử là hình thức đổi mới tế bào khi vi khuẩn sống trong môi trường bất lợi như nhiệt độ, áp suất, dinh dưỡng… không phù hợp cho việc sinh trưởng và phát triển bình thường
72
của chúng hoặc khi tế bào trở nên già. Ở vi khuẩn lactic, chúng không có khả năng này nên đây cũng trở thành đặc điểm của chúng.
Sự hình thành bào tử là hình thức đổi mới tế bào khi vi khuẩn sống trong môi trường bất lợi như nhiệt độ áp suất dinh dưỡng… không phù hợp cho việc sinh trưởng và phát triển bình thường của chúng hoặc khi tế bào trở nên già. Ở vi khuẩn lactic chúng không có khả năng này nên đây cũng trở thành đặc điểm của chúng.
Sau khi nhuộm bào tử vi khuẩn bằng phương phá Schaeffer-Fulton sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis nuôi cấy hơn 1 tuần làm đối chứng dương quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100x sẽ thấy được các bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis bắt màu xanh của thuốc nhuộm Malachite green và vi khuẩn E.coli làm đối chứng âm.
Tiến hành nhuộm bào tử 3 chủng vi khuẩn Lactobacillus spp.
Hình 3.3: Kết quả nhuộm bào tử của các vi khuẩn: Từ trái qua qua phải, vi khuẩn Bacillus subtilis sinh bào tử, vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 không sinh bào tử
Kết quả: Các chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, Lactobacillus sp. L3, Lactobacillus sp. L2N không sinh bào tử và bắt màu hồng dưới thuốc nhuộm bổ sung.
3.1.4 Thử nghiệm Catalase:
Ở vi khuẩn, loài có enzyme catalase thì vi khuẩn đó có khả năng chuyển hóa H2O2
thành H2O và O2 khi cho H2O2 lên sinh khối của chúng thì sẽ có hiện tượng sủi bọt khí,
73
sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis và nước cất có ở phòng thí nghiệm để làm đối chứng dương và âm hình 3.4.
Theo khóa phân loại của Bergey thì vi khuẩn lactic có thử nghiệm catalase âm tính.
Hình 3.4: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 (Từ trên xuống:
Thử nghiệm âm tính vi khuẩn L5, thử nghiệm dương tính với vi khuẩn Bacillus subtilis)
Kết quả: Thử nghiệm cho thấy 3 chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, Lactobacillus sp. L3, Lactobacillus sp. L2N không có khả năng sinh catalase. Thử nghiệm được so sánh với chủng vi khuẩn Bacillus subtilis.
3.1.5 Thử nghiệm tính di động:
Ở vi khuẩn có tiên mao, chúng sẽ có khả năng di động, vì vậy trong môi trường thạch mềm, chúng sẽ phát triển lan sang môi trường xung quanh vết cấy chứ không mọc theo vết cấy, tạo thành những vệt mờ đục môi trường.
Vi khuẩn Lactobacillus spp. là vi khuẩn hiếu khí chịu oxy nên chúng vừa có thể phát triển ở phía trên vừa có thể phát triển ở sâu trong môi trường ở những chủng không có tiên mao, chúng sẽ tăng sinh khối theo vết cấy vì chúng không có khả năng di chuyển, vì vậy ta thấy một vệt thẳng theo vết cấy.
Các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. chỉ mọc dọc theo đường cấy, môi trường không đục.
74
Hình 3.5: Thử nghiệm tính di động của chủng Lactobacillus sp. L5 và chủng vi khuẩn đối chứng Bacillus subtilis.
Kết quả: Các chủng Lactobacillus sp. L5, Lactobacillus sp. L3, Lactobacillus sp.
L2N không có khả năng di động.
3.1.6 Thử nghiệm lên men các loại đường:
Đối với lên men đồng hình, acid lactic là sản phẩm duy nhất theo con đường đường phân, đối với lên men dị hình vì sử dụng con đường 6- phosphorgluconate /phosphoketolase vì thế thì ngoài acid lactic còn có CO2. Như vậy, nếu chỉ sinh acid, không sinh khí thì LAB thuộc nhóm lên men đồng hình. Ngược lại nếu cả acid và khí tạo thành LAB thuộc nhóm lên men dị hình.
75
Các chủng LAB khác nhau có khả năng lên men các loại đường khác nhau.
Hình 3.6: Khả năng lên men các loại đường của vi khuẩn L5 (I), L2N (II), L3 (III) (A – Glucose; B – Fructose; C – Sucrose; D – Mannose; E – Mannitol; F – Galactose)
Bảng 3.1 Khả năng lên men các loại đường của các chủng Lactobacillus sp. L5, L3, L2N.
Chủng
L5 L3 L2N
Glucose +++ + +++
Fructose +++ + +++
Đường
76