3.3. Khảo sát môi trường lên men thích hợp
3.3.5. Đánh giá khả năng kháng nấm invitro của các chủng vi khuẩn lactic
Theo một số nghiên cứu gần đây cho biết vi khuẩn lactic có khả năng kháng nấm nhờ sản xuất 1 số chất như acid hữu cơ và reuterin các peptide các enyzme để ức chế sự tăng trưởng của nấm hư hỏng trên hạt giống. Nhằm mục đích tuyển chọn ra các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm thì nhóm thực hiện đề tài đã chọn ra phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn đây l phương pháp đơn giản dễ thực hiện và kết quả đạt được cũng phần nào nói lên được khả năng ức chế nấm bệnh của vi khuẩn lactic trong thí nghiệm. Khả năng đối kháng nấm của vi khuẩn lactic sau 3 ngày thể hiện khác nhau và được trình bày đại diện qua chủng mạnh nhất qua các hình. Khả năng đối kháng được xác định dựa trên đường kính vòng ức chế của vi khuẩn đối với nấm mốc so với đối chứng và được trình bày trên hình và bảng dưới.
94
Hình 3.23: Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn L5 (I); L2N (II); L3 (III) (A – Daconil 0.5g/L; B – MRS cải tiến; B – Nước giá; C – Nước bắp cải; E- ĐC (-))
Bảng 3.5: Thống kê số liệu phần trăm tỷ lệ ức chế của 3 chủng vi khuẩn trên 3 môi trường nuôi cấy MRS Broth, bắp cải, nước giá, với đối chứng (+) Daconil với
chủng nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn.
L5 L2N L3
Đối chứng (+)
Daconil 26.85b±3.91 26.85b±3.91 26.85b±3.91 Chủng VK
NT
E
E
E
95
MRS 42.610a ± 1.53 41.380a ± 2.99 45.813a ± 1.48
Bắp Cải 40.887a ± 1.95 44.333a ± 4.07 44.597a ± 3.39
Nước Gía 42.857a ± 4.45 45.070a ± 4.07 43.597a ± 3.79
Hình 3.24: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ kháng nấm của 3 chủng vi khuẩn trên 3 môi trường khác nhau.
Sau khi xử lý ANOVA với độ tin cậy là 99%, dựa trên các kết quả nhóm đề tài nhận thấy:
Tỷ lệ kháng nấm khi thực hiện trên 3 môi trường khảo sát cao hơn đối chứng là 0.00
10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
L5 L2N L3
Tỉ lệ kháng nấm (%)
Chủng vi khuẩn
ĐC (+) MRS Broth Nước giá Nước bắp cải
96
Daconil (0.5g/l). Theo kết quả xử lý thống kê thì kết quả kháng nấm trên 3 môi trường Mrs Broth, nước giá và bắp cải xếp đồng hạng a và cao hơn so với đối chứng (+) Daconil (0.5g/l) xếp hạng b.
Không có sự chênh lệch nhiều về tỷ lệ phần trăm kháng nấm của 3 chủng vi khuẩn trên 3 môi trường khảo sát MRS, nước giá và bắp cải.
Như vậy trong các tính chất sinh học của các chủng LAB thí nghiệm trong 3 môi trường có thề thấy:
Trong môi trường nước giá đậu và bắp cải sau thời gian nuôi cấy 24 giờ, sinh khối 3 chủng LAB ở môi trường bắp cải tương đương và bằng 90.9 % so với môi trường MRS còn ở môi trường giá đâu là 90% so với môi trường MRS, acid lactic tổng hợp ở môi trường bắp cải bằng 70 % so với môi trường MRS và trên môi trường giá đậu là 64.8 % so với môi trường MRS, khả năng sinh IAA vượt trội trong môi trường bắp cải, khả năng phân giải lân cao nhất trong môi trường nước giá, khả năng tạo màng biofim trên môi trưởng bắp cải tốt hơnvà khả năng kháng nấm tương đương giữa môi trường nước giá, bắp cải và môi trường MRS.
Nhận thấy các hoạt tính sinh học khảo sát trên môi trường bắp cải tốt hơn so với giá đậu nên nhóm đề tái quyết định chọn bắp cải là môi trường lên men cho các thử nghiệm sau.
3.3.6. Khảo sát khả năng bảo quản hạt đậu phộng
Vi khuẩn lactic có khả năng kháng nấm và chúng có khả năng tạo màng biofilm khi nuôi cấy trong môi trường bắp cải. Thí nghiệm này được thực hiện nhằm thăm dò
khả năng phối hợp giữa 3 chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L2N, L3 để tạo màng bao kháng nấm Aspergillus sp. CĐP1.
Thí nghiệm được thực hiện khi phối hợp ba chủng vi khuẩn lactic L5, L2N, L3 với những tỷ lệ phối trộn khác nhau và những chế độ xử lý nhiệt khác nhau, sau đó điều chỉnh pH về 5 hoặc 6.
Kết quả được trình bày trong bảng dưới đây
97
Hình 3.25: Hình ảnh bảo quản đậu phộng trong chai sau 25 ngày
98
Bảng 3.6: Ngày xuất hiện tơ nấm trong thí nghiệm bảo quản hạt đậu phộng sau 25 ngày khảo sát
Nghiệm thức
Ngày đầu tiên mọc nấm TN1(Không
điều chỉnh pH)
TN2 (pH5)
TN3 (pH6)
Đối chứng 1 – nước cất 14
Đối chứng 2 – Daconil (0.5g/l) 21
NT1 – 1 : 1 : 1 – t0 phòng * 18 21
NT2 – 1 : 2 : 1 – t0 phòng 21 21 25
NT3 – 1 : 1 : 2 – t0 phòng 18 18 21
NT4 – 1 : 1 : 1 – 650C/15 phút 14 14 25 NT5 – 1 : 2 : 1 – 650C/15 phút 21 21 21 NT6 – 1 : 1 : 2 – 650C/15 phút 18 18 25 NT7 – 1 : 1 : 1 – 850C/10 phút 25 14 18
NT8 – 1 : 2 : 1 – 850C/10 phút 21 14 *
NT9 – 1 : 1 : 2 – 850C/10 phút 25 25 25 NT10 – 1 : 1 : 1 – 1000C/3 phút 21 21 21 NT11 – 1 : 2 : 1 – 1000C/3 phút 14 14 21
NT12 – 1 : 1 : 2 – 1000C/3 phút * 18 25
(Chú thích: * không có sự nhiễm nấm sau 25 ngày khảo sát)
Nhận thấy: Nhìn chung các nghiệm thức cho khả năng kháng nấm tốt hơn nước cất, đặc biệt ba nghiệm thức TN1-NT1, TN1-NT12, TN3-NT8 cho khả năng kháng nấm tốt hơn đối chứng Daconil.
99
- TN1-NT1 (1:1:1) khi không gia nhiệt thì thí nghiệm bảo quản hạt kéo dài hơn 30 ngày không thấy sự mọc nấm. Rõ ràng là trong trường hợp này acid hữu cơ là tác nhân kháng nấm do khả năng phân ly không hoàn toàn trong môi trường pH thấp, khuếch tán qua màng sinh chất dẫn đến giảm pH trong tế bào (phân ly thành ion trong môi trường trung tính nội bào).
- TN1-NT12 (1:1:2) khi gia nhiệt ở 1000C/3 phút không trung hòa thí nghiệm bảo quản hạt cũng kéo dài hơn 30 ngày mà vẫn không thấy mọc nấm. Kết quả này tương tự như trường hợp trên nhưng tỉ lệ vi khuẩn có điểm khác biệt là mật độ L2N cao gấp đôi mật độ hai vi khuẩn còn lại cho thấy ngoài tác nhân kháng nấm là acid hữu cơ, tác nhân kháng nấm ở L2N có thể còn do hợp chất không phải là protein nên không những không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, mà chế độ nhiệt 100
0C, 3 phút có thể gây biến đổi thuận lợi hơn cho sự kháng nấm.
- TN3-NT8 (1:2:1) khi gia nhiệt ở 850C/10 phút, trung hòa đến pH = 6, thí nghiệm bảo quản hạt kéo dài hơn 30 ngày vẫn không thấy sự mọc nấm Trường hợp này chủng L3 có mật độ cao gấp đôi 2 chủng còn lại, chế độ xử lý nhiệt tương tự trường hợp trên là điều kiện thanh trùng. Như vậy hoạt chất kháng nấm nổi bật ở chủng L3 không phải là protein và không phải là acid hữu cơ, nhưng chất này hoạt động trong điều kiện pH 6 tốt hơn cả, và tương tự xử lý nhiệt giúp chất này hoạt động tốt hơn (biến tính các protein tương tác).
Đây chỉ là những kết quả ban đầu, các nghiên cứu sâu hơn về bản chất các hợp chất kháng nấm cần được tiếp tục nghiên cứu.
100
3.3.7. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5, L2N, L3 tới sự phát triển của hạt giống.
3.3.7.1. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5, L2N, L3 tới khả năng phát triển của cây đậu phộng 7 ngày sau nảy mầm.
Sau khi xác định được khả năng kháng nấm vượt trội của 3 nghiệm thức TN3-NT8, TN1-NT1 và TN1-NT12 nhóm đề tài tiếp tục tiến hành khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy 3 nghiệm thức trên trong khả năng kích thích phát triển hạt đậu phộng.
Bảng 3.7 Thành phần các nghiệm thức ngâm hạt đậu phộng.
Kí hiệu Thành phần
TN1-NT1 L5:L2N:L3 tỷ lệ 1:1:1, không gia nhiệt, không điều chỉnh pH, bổ sung Tween 80
TN1-NT12
L5:L2N:L3 tỷ lệ 1:1:2, gia nhiệt 100 °C trong 3 phút, không điều chỉnh pH, bổ sung Tween 80
TN3-NT8
L5:L2N:L3 tỷ lệ 1:2:1, gia nhiệt 85 °C, điều chỉnh về pH=6, bổ sung Tween 80
Hạt đậu phộng sau khi được ngâm trong dịch vi khuẩn của 3 nghiệm thức trên sẽ được làm khô và khảo sát khả năng nảy mầm trên đất.
101
Hình 3.26: Cây đậu phộng 7 ngày sau nảy mầm
Bảng 3.8: Tỷ lệ nảy mầm và độ khoẻ mầm trên các nghiệm thức của hạt đậu phộng.
Nghiệm thức Tỷ lệ nảy mầm (%) Độ khoẻ mầm
Nước cất 66.6b ± 2.88 61.5b ± 3.35
Daconil (0.5 g/l) 73.3b ± 7.63 76b ± 10.8
TN1-NT1 76.6ab ± 7.63 115.2b ± 10
TN3-NT8 88.3a ± 7.63 135.4a ± 12.3
TN1-NT12 76.6ab ± 10.4 115.8b ± 15.2
ĐC (-) ĐC (+) TN1-NT1 TN1-NT12 TN3-NT8
102
Hình 3.27 Tỷ lệ nảy mầm và độ khoẻ của mầm trên các nghiệm thức của hạt đậu phộng
Kết quả xử lý thống kê ANOVA cho thấy tỷ lệ nảy mầm của ba nghiệm thức dịch vi khuẩn cao hơn so với đối chứng nước cất và Daconil. Đặc biệt nghiệm thức TN3- NT8 cho tỷ lệ nảy mầm cao hơn 21.7% so với nước cất và 15.4% so với đối chứng (+) Daconil.
Về độ khoẻ của mầm nhận thấy cả ba nghiệm thức dich nuôi cấy vi khuẩn lactic cho độ khoẻ của mầm vượt trội so với hai nghiệm thức đối chứng nước cất và daconil, đặc biệt nghiệm thức TN3-NT8 (135.4a ± 12.3) cho độ khoẻ nảy mầm vượt trội so với 2 nghiệm thức dịch nuôi cấy vi khuẩn còn lại.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0 20 40 60 80 100 120 140 160
ĐC (-) Nước cất ĐC (+) Daconil TN1-NT1 TN3-NT8 TN1-NT12
%
Nghiệm thức
Độ khoẻ mầm Tỷ lệ nảy mầm
103
Bảng 3.9 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn đến chiều dài và sinh khối rễ, thân 7 ngày sau nảy mầm.
Nghiệm thức Chiều dài rễ (mm)
Chiều dài thân (mm)
Sinh khối rễ (g)
Sinh khối thân (g) ĐC (-) Nước
cất 43.3b ± 2.88 49b ± 6.55 0.21b ± 0.02 0.89bc ± 0.02 ĐC(+) Daconil 48b ± 7.21 55.6b ± 2.51 0.22b ± 0.03 0.86c ± 0.04
TN1-NT1 68.6a ± 2.3 81.6a ± 3.05 0.28ab ± 0.04 1.09ab ± 0.03 TN1-NT12 67.6a ±2.51 83.3a ± 5.68 0.59a ± 0.24 1.04a ± 0.08
TN3-NT8 68.3a ± 3.51 85a ± 2 0.58a ± 0.31 1.03ab ± 0.17
Hình 3.28 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn của 3 nghiệm thức TN1-TN1, TN3-NT8 và TN1-NT12 đến chiều dài và sinh khối rễ, thân 7 ngày sau nảy
mầm
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
ĐC (-) Nước
cất ĐC (+) Daconil TN1-NT1 TN3-NT8 TN1-NT12
Trọng lượng (g)
Chiều dài (mm)
Nghiệm thức
Chiều dài rễ Chiều dài thân Sinh khối rễ Sinh khối thân
104
Kết quả xử lý thống kê ANOVA cho thấy các chỉ tiêu về chiều dài cũng như sinh khối đều vượt trôi so với đối nước nước cất và daconil.
Ở chỉ tiêu chiều dài rễ và chiều dài thân nghiệm thức TN3-NT8 cho ảnh hưởng chiều dài rễ tốt nhất (68.3a ± 3.51) mm và chiều dài thân (85a ± 2), nhưng không có sai khác về ý nghĩa thống kê với 2 nghiệm thức dịch nuôi cấy vi khuẩn còn lại.
Về chỉ tiêu sinh khối rễ nghiệm thức TN1-NT12 cho ảnh hưởng chiều dài tố nhất (0.59a ± 0.24) và đồng hạng thống kê với TN3-NT8 và cao hơn nghiệm thức TN1- NT1 (0.28ab ± 0.04).
Ở chỉ tiêu sinh khối thân nhận thấy 3 nghiệm thức dich nuôi cấy vi khuẩn cao hơn so với đối chứng nước cất và daconil, nghiệm thức TN1-TN12 cho kết quả về sinh khối thân tốt nhất với giá trị khối lượng (1.04a ± 0.08) g, và hai nghiệm thức dịch nuôi cấy vi khuẩn còn lại đồng hạng với nhau.
3.3.7.2. Khảo sát khả năng ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5, L2N, L3 tới cây đậu phộng 14 ngày sau nảy mầm.
Bảng 3.10: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đối với chiều dài của cây đậu phộng sau 14 ngày nảy mầm
Nghiệm thức
Chiều dài rễ (mm)
Chiều dài thân (mm)
Sinh khối rễ (g)
Sinh khối thân (g) Đối chứng (-)
Nước cất 72.6b ± 3.21 101.6b ± 2.88 0.54c ± 0.55 1.05b ± 0.06 Đối chứng (+)
Daconil 0,5g/l 70.6b ± 6.02 108.3b ±7.63 0.57bc ± 0.09 1.54b ± 0.04 TN1-NT1 89.3a ± 7.37 136.3a ± 6.02 0.69ab ± 0.02 1.91a ± 0.03 TN1-NT12 88a ± 1 136.6a ± 7.63 0.72a ± 0.08 1.93a ± 0.05 TN3-NT8 88.3a ± 7.09 140a ± 8.66 0.71ab ± 0.1 1.98a ± 0.07
105
Hình 3.29: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng dịch nuôi cấy của 3 nghiệm thức TN1-NT1, TN1-NT12, TN3-NT8 cây đậu phộng 14 ngày sau nảy mầm.
Kết quả sau khi xử lý số liệu trên ANOVA và phần mềm Excel từ bảng và hình cho thấy, ở ngày 14 dịch nuôi cấy các nghiệm thức vi khuẩn vẫn ảnh hưởng tích cực đến khả năng tăng chiều dài rễ , chiều dài thân và sinh khối rễ, sinh khối thân tốt hơn 2 đối chứng Daconil và nước cất.
Và không có sự sai khác về mặt thống kê giữa các nghiệm thức vi khuẩn ở các chỉ tiêu chiều dài rễ, chiều dài thân, và sinh khối thân khả năng ảnh hưởng của các nghiệm thức vi khuẩn tương đương nhau. Còn ở chỉ tiêu chiều sinh khối rễ TN1-NT12 cho kết quả tốt nhất (0.72a ± 0.08) g.
0 0.5 1 1.5 2 2.5
0 20 40 60 80 100 120 140 160
ĐC (-) Nước
cất ĐC (+) Daconil TN1-NT1 TN3-NT8 TN1-NT12
Trọng lượng (g)
Chiều dài (mm)
Nghiệm thức
Chiều dài rễ Chiều dài thân Sinh khối rễ Sinh khối thân
106
Hình 3.30: Cây đậu phộng 14 ngày sau nảy mầm.
Cây đậu từ hạt giống xử lý với dịch vi khuẩn có khả năng nảy mầm, sinh trưởng và phát triển tốt hơn so với hạt đậu phộng có hạt xử lý với nước cất. Những cây có hạt xử lý với dịch vi khuẩn lactic ở các nghiệm thức TN1-NT1, TN1-NT12, TN3-NT8 cho thấy sự sinh trưởng cao hơn so với đối chứng nước cất và daconil.
Ở nghiệm thức xử lý hạt với daconil, daconil là thuốc hóa học phòng trừ nấm, có khả năng kiểm soát nấm và bệnh, trong khoảng thời gian từ lúc gieo đến khi thu kết quả ít có sự xuất hiện của nấm mốc so với nước cất và hạt phát triển bình thường. Ở thí nghiệm ngâm hạt với chế phẩm vi khuẩn, ban đầu xung quanh hạt có xuất hiện một ít tơ nấm trắng nhưng biến mất sau một thời gian, lá mầm chỉ hư hại hại nhỏ nhưng kết
ĐC (-) ĐC (+) TN1-
NT1
TN1- NT12
TN3- NT8
107
quả tốt hơn so với nước cất. Ở các nghiệm thức xử lý với chế phẩm vi khuẩn, ta nhận thấy lá và rễ của các cây xử lý với chế phẩm tốt hơn và mạnh hơn so với xử lý bằng hai đối chứng, nguyên nhân là do khả năng sinh tổng hợp hormone tăng trưởng thực vật IAA của vi khuẩn cũng như các khả năng giúp cây trồng phát triển khác như khả năng phân giải lân, tạo màng biofilm và khả năng đối kháng nấm.
108
ĐỀ NGHỊ QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG VÀ BẢO QUẢN HẠT CỦA CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS
SP. L5, L3, L2N Bắp cải
Xử lý
Tiệt trùng 121 0C/15phút Chuẩn bị môi trường
nuôi cấy
Nuôi cấy ở 37 0C/24 giờ
Nhân giống trên môi trường MRS broth ở 37 0C/24 giờ
Các chủng L5, L3, L2N
Phối trộn L5:L3:L2N theo tỷ lệ 1:2:1, gia nhiệt 85
0C/10 phút, điều chỉnh pH6
Hạt đậu phộng đã xử lý Ngâm hạt đậu phộng 15 phút
Sấy 850C đến độ ẩm <10%
109 Thuyết minh quy trình:
- Hoạt hóa, tăng sinh các chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L3, L2N trong môi trường tăng sinh MRS Agar ở 37 0C trong 24 giờ.
- Bắp cải xử lý thu dịch chiết chuẩn bị môi trường nuôi cấy có bổ sung thêm pepton và glucose. Tiệt trùng môi trường 121 0C/15 phút
- Cấy các chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L3, L2N vào môi trường bắp cải nuôi cấy 37 0C trong 24 giờ.
- Sau 24 giờ, tạo chế phẩm bằng cách phối trộn các chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L3, L2N lần lượt theo tỷ lệ 1:2:1 điều chỉnh pH 6 đồng thời gia nhiệt lên 85 0C trong vòng 10 phút.
- Tiến hành ngâm hạt 15 phút.
- Sấy hạt 850C đến độ ẩm <10%.
- Bảo quản khô ráo.