CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.8. Phương pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết
Nguyên tắc: Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết bằng các phản ứng hóa học theo các phương pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm đã được chuẩn hóa để sơ bộ hóa thành phần hoạt chất (Lương Văn Tiến và ctv, 2015).
Cách tiến hành: Cao chiết được đem ngâm trong dung môi thích hợp, tiến hành lọc và thu dịch lọc. Sau đó dùng dịch cao chiết này tiến hành định tính các thành phần hóa học với các loại hóa chất, thuốc thử đặc trưng.
2.3.8.1. Định tính carbohydrate
Thử nghiệm Molisch: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho 2 giọt thuốc thử Molisch vào, tiếp tục nhỏ từ từ 2 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc vào và đọc kết quả. Kết quả được xem là dương tính khi có hình thành phức hợp màu đỏ - tím.
Thử nghiệm Fehling: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, cho lần lượt 1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B vào. Đun cách thủy 5 phút và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi có xuất hiện tủa màu đỏ của Cu2O.
Thử nghiệm Barfoed: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Barfoed. Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, làm lạnh và đọc kết quả.
Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu đỏ gạch (Yadav và ctv, 2013).
50 2.3.8.2. Định tính saponin
Thử nghiệm tạo bọt: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 2 ml nước cất vào lắc mạnh. Kết quả dương tính khi ống nghiệm có xuất hiện bọt và ổn định (Abba và ctv, 2009).
2.3.8.3. Định tính alkaloid
Thử nghiệm Mayer: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer và đọc kết quả. Kết quả dương tính là khi quan sát được kết tủa màu trắng đục tạo thành.
Thử nghiệm Dragendorff: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu vàng cam.
Thử nghiệm Hager: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml thuốc thử Hager và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu vàng.
Thử nghiệm Wagner: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và bổ sung 2 ml thuốc thử Wagner vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính là khi hình thành kết tủa màu nâu đỏ (Yadav và ctv, 2013).
2.3.8.4. Định tính cardiac glycoside
Thử nghiệm Legal: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml pyridine hoặc 1 ml Na nitro prusside, sau đó bổ sung 5 giọt NaOH 10% vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện màu đỏ đậm.
Thử nghiệm Keller Killiani: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml acid acetic glacial và 1 ml dung dịch FeCl3, cho từ từ 1 ml H2SO4 đậm đặc vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện màu xanh trong lớp acid acetic (Yadav và ctv, 2013)
2.3.8.5. Định tính anthraquinone glycoside
Thử nghiệm Bontrager: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml dung dịch H2SO4 loãng và đun sôi, sau đó tiến hành lọc nóng và để nguội dịch lọc, bổ sung thêm 3 ml benzene lắc đều rồi để yên, tách lấy lớp benzene cho vào
51
ống nghiệm khác, tiếp tục thêm 2 ml ammonia và quan sát màu trong lớp ammonia.
Kết quả dương tính khi xuất hiện màu hồng hoặc đỏ (Abba và ctv, 2009).
2.3.8.6. Định tính flavonoid
Thử nghiệm Alkaline: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm rồi cho vào 5 giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng, thêm vài giọt HCl loãng vào thấy ống nghiệm về màu cao ban đầu chứng tỏ có sự hiện diện của Flavonoid (mẫu đối chứng làm tương tự, thay NaOH 10% thành nước cất). Kết quả dương tính nếu xuất hiện màu vàng đậm khi bổ sung NaOH và trở về màu cao ban đầu khi bổ sung HCl. Có thực hiện ống đối chứng dương thay NaOH thành nước cất.
Thử nghiệm Shinoda: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, cho một ít bột Magnesium vào, cho từ từ 1 ml HCl đậm đặc vào sát thành ống nghiệm. Sau đó thêm 5 ml ethanol 95% và đọc kết quả. Kết quả dương tính là khi mẫu có xuất hiện cam, hồng, đỏ đến tím,..
Thử nghiệm Ferric chloride: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó thêm vài giọt thuốc thử Ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện màu xanh hoặc tím (Mamta và ctv, 2012).
2.3.8.7. Định tính các hợp chất phenol
Thử nghiệm Lead acetate: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, rồi cho vào 3 ml lead acetate 10% sau đó đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện kết tủa trong ống nghiệm.
Thử nghiệm Gelatin: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt galatin 10% vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện kết tủa trắng.
(Mamta và ctv, 2012).
2.3.8.8. Định tính tannin
Thử nghiệm Ferric chloride: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%, cho4 giọt thuốc thử ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện tủa màu xanh, xanh – đen (Abba và ctv, 2009).
52
Thử nghiệm Lead acetate: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%, cho 4 giọt thuốc thử lead acetate 10% vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện màu vàng (Mamta và ctv, 2012).
2.3.8.9. Định tính steroid
Thử nghiệm Salkowski: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vào 2 ml chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc, lắc mạnh rồi để yên cho tách thành 2 lớp đọc kết quả ở mặt phân cách. Kết quả xác định được chia thành 2 trường hợp: ở lớp dưới xuất hiện màu đỏ là sterol, xuất hiện màu vàng là triterpenoid.
Thử nghiệm Libermann Burchard: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm thêm 2 ml acid anhydride, sau đó nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc theo thành ống nghiệm rồi đọc kết quả. Kết quả xác định được chia thành 2 trường hợp: Xuất hiện vòng màu nâu ở mặt phân cách và lớp trên có màu xanh lá là sterol. Hình thành màu đỏ đậm là triterpenoid (Mamta và ctv, 2012).
2.3.8.10. Định tính amino acid
Thử nghiệm Ninhydrin: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho vào một vài giọt thuốc thử Ninhydrin, đun sôi 5 phút và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi thấy xuất hiện màu tím (Yadav và ctv, 2013).