CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Bố trí thí nghiệm
2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các loại cao chiết ethanol đối với
2.4.2.1. Quy trình thí nghiệm
57
Nhỏ dịch
Hình 2.8. Quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết.
Nhỏ dịch Hỳt 100 àl dịch
vi khuẩn
Đo đường kính vòng kháng khuẩn
Cao chiết
Hòa tan DMSO 1%
Nồng độ 100 mg/ml Vi sinh vật chỉ thị
Lắc nhiệt độ phòng (18 – 24 giờ) Tăng sinh trong môi trường TSB
Đo OD600nm
Pha loãng về 106 cfu/ml
Môi trường TSA
Đổ đĩa Hấp tiệt trùng 1210C – 1 atm trong 15 phút
Đục lỗ (d= 6 mm)
Ủ 370C/24 giờ Cấy trang
58 2.4.2.2. Thuyết minh quy trình
Trong thí nghiệm này, tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đài hoa bụp giấm bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch.
Các chủng vi khuẩn chỉ thị được tăng sinh trong erlen chứa 10 ml môi trường TSB (riêng với các chủng Vibrio spp. có bổ sung thêm 1,5% NaCl), để lắc với tốc độ 120 vòng/phút từ 18 - 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau khi lắc được đo OD ở bước sóng 600 nm để xác định mật độ tế bào và pha loãng bằng các ống nước muối sinh lí vô trùng để đạt mật độ tế bào vi khuẩn 106 cfu/ml.
Hỳt 100 àl dịch vi khuẩn đó được pha loóng cho lờn trung tõm đĩa thạch TSA đã chuẩn bị sẵn (riêng các chủng Vibrio spp. môi trường TSA có bổ sung 1,5%
NaCl). Tiến hành trang khô, đều dịch vi khuẩn khắp bề mặt đĩa thạch trong điều kiện vô trùng, dán nhãn các chủng vi khuẩn tương ứng.
Dùng que đục đã khử trùng có đường kính d = 6 mm, đục 3 hoặc 6 giếng trên bề mặt đĩa thạch sau khi trang, mỗi giếng cách nhau 2 cm và cách mép đĩa 1cm.
Dùng dao vô trùng lấy phần thạch đã đục ra khỏi đĩa.
Các loại cao chiết được hòa tan bằng DMSO 1% theo nồng độ 100 mg/ml. Hút vào mỗi giếng 100 àl dịch cao hoặc chất khỏng sinh (đối với mẫu đối chứng).
Hình 2.9. Giếng thạch trước và sau khi bổ sung cao
59
Các đĩa petri được để yên ở nhiệt độ phòng 2 giờ để dịch cao chiết từ các giếng khuếch tán vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn, sau đó ủ ở tủ ấm 370C trong thời gian 18 - 24h và đọc kết quả.
Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng ức chế (tính bằng mm) và so sánh đường kính vòng ức chế của các loại cao được chiết bằng dung môi khác nhau và với mẫu đối chứng để khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi tách chiết.
Mẫu đối chứng là ciprofloxacin 8 àg/ml với chủng Vibro spp. và 500 àg/ml với các chủng còn lại.
Thí nghiệm được lặp lại ba lần và lấy giá trị đường kính trung bình.
2.4.3. Thí nghiệm 3: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết ethanol 50% từ cây bụp giấm đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh.
Kết thúc thí nghiệm 2 nhận thấy cao chiết bụp giấm 50% có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất. Vì vậy, mẫu cao chiết này sẽ được sử dụng để xác định chỉ số MIC đối với các chủng vi khuẩn đối kháng bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (Agar Well Diffusion Method).
2.4.3.1. Quy trình thí nghiệm
Hình 2.10. Vòng kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% (100 mg/ml) đối với chủng Staphylococcus aureus (A) và Samolnella enteritidis (B)
A B
60
Hình 2.11.Quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết
Hỳt 100 àl dịch vi khuẩn
Ủ 370C/24h
Đo đường kính vòng kháng khuẩn cấy trang
Vi sinh vật chỉ thị
Tăng sinh trong môi trường TSB
Lắc nhiệt độ phòng (18 – 24 giờ)
Đo OD600nm
Pha loãng về 106cfu/ml
Môi trường TSA
Hấp tiệt trùng 1210C – 1 atm trong 15 phút
Đổ đĩa
Đục lỗ (d= 6 mm) Pha loãng
Cao ở các nồng độ: 50-25 mg/ml
Cao chiết ethanol 70%Cao chiếtCao chiếtCao chiếtCao chiết Cao chiết 100
mg/ml
DMSO 1%
61 2.4.3.2. Thuyết minh quy trình
Các chủng vi khuẩn chỉ thị được tăng sinh trong erlen chứa 10 ml môi trường TSB (riêng với các chủng Vibrio spp. có bổ sung thêm 1,5% NaCl), để lắc với tốc độ 120 vòng/phút từ 18 - 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau khi lắc được đo OD ở bước sóng 600 nm để xác định mật độ tế bào và pha loãng bằng các ống nước muối sinh lí vô trùng để đạt mật độ tế bào vi khuẩn 106 cfu/ml.
Hỳt 100 àl dịch vi khuẩn đó được pha loóng cho lờn trung tõm đĩa thạch TSA đã chuẩn bị sẵn (riêng các chủng Vibrio spp. môi trường TSA có bổ sung 1,5%
NaCl). Tiến hành trang khô, đều dịch vi khuẩn khắp bề mặt đĩa thạch trong điều kiện vô trùng, dán nhãn các chủng vi khuẩn tương ứng. Dùng que đục đã khử trùng có đường kính d = 6 mm, đục 3 hoặc 6 giếng trên bề mặt đĩa thạch sau khi trang, mỗi giếng cách nhau 2 cm và cách mép đĩa 1cm. Dùng dao vô trùng lấy phần thạch đã đục ra khỏi đĩa.
Cao chiết ethanol 50% được hòa tan bằng DMSO 1% theo nồng độ 100 mg/ml. Sau đó pha loãng mẫu cao theo dãy nồng độ 50 – 25 mg/ml vào mỗi bình thủy tinh đó được khử trựng. Hỳt vào mỗi giếng 100 àl dịch cao. Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần trên từng chủng vi sinh vật chỉ thị..Các đĩa petri được để yên ở nhiệt độ phòng 2 giờ để dịch cao chiết từ các giếng khuếch tán vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn, sau đó ủ ở 370C trong thời gian 18 - 24h và đọc kết quả.
Chỉ số MIC được xác định ở nồng độ dịch chiết thấp nhất mà tại đó đường kính vòng ức chế vi khuẩn chỉ thị xuất hiện.
62