CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp chiết mẫu thực vật
Mẫu thực vật được chiết theo phương pháp chiết rắn-lỏng và phương pháp chiết lỏng-lỏng [5].
Đối với kỹ thuật chiết rắn-lỏng: luận án sử dụng kỹ thuật chiết ngâm dầm kết hợp với máy siêu âm để gia tăng hiệu quả chiết. Mẫu cây A. armata được ngâm trong dung môi methanol và sử dụng máy siêu âm để đẩy nhanh quá trình chiết xuất. Quá trình chiết với máy siêu âm được lặp lại 03 lần, mỗi lần 30 phút ở nhiệt độ 50 oC. Sau các lần chiết xuất, dịch chiết được lọc và gộp lại. Dịch chiết được thu hồi dung môi methanol bằng máy cô quay chân không, thu được cao tổng methanol.
Đối với kỹ thuật chiết lỏng-lỏng: Cao tổng methanol được hòa tan vào một lượng methanol tối thiểu, sau đó thêm vào một lượng lớn nước cất và chiết phân bố lần lượt với các dung môi dichloromethane, ethyl acetate. Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi. Các dịch chiết được cất loại dung môi dưới áp suất thấp bằng máy cất quay chân không sẽ thu được các cao chiết tương ứng (cao dichloromethane, ethyl acetate và lớp nước).
2.4.2. Phương pháp phân lập các hợp chất
Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715) và RP-18 F254s. Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm và dùng thuốc hiện màu (H2SO4 5 % trong ethanol) phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu.
Sắc ký lớp mỏng điều chế được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60G F254 (Merck 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm và cắt bản mỏng để phun thuốc hiện màu (H2SO4 5 % trong ethanol), hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp silica gel có chất, dùng dung môi thích hợp để hòa tan chất, cô đuổi dung môi để thu chất.
Sắc ký cột (CC) được tiến hành với chất hấp phụ silica gel pha thường có cỡ hạt là 40 - 63 m, silica gel pha đảo YMC RP-18 (30 - 50 m) và nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 [5].
2.4.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất
Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là sự kết hợp giữa các thông số vật lý, các dữ kiện phổ và so sánh với các tài liệu tham khảo.
a. Góc quay cực
Góc quay cực được đo trên máy Jasco P2000 polarimeter tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
b. Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS)
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
Phổ khối lượng phân giải cao được đo trên máy Agilent 6530 Accurate Mass Q-TOF LC/MS tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
c. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) được đo trên máy Bruker 500MHz Spectrometer (với TMS là chất chuẩn nội) tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.4.4. Phương pháp xác định đồng phân quang học của đường đơn
Hợp chất được hòa tan trong 0.5 mL dung dịch HCl 6 N và đun nóng ở 60 oC trong 1,5 giờ. Sau khi làm lạnh, hỗn hợp được lắc với dung môi EtOAc. Lớp acid thu được được trung hòa với dung dịch NaOH 1 N và được sấy lạnh. Các đường sau đó được phân tách và so sánh với đường chuẩn bằng sắc ký bản mỏng điều chế với hệ dung môi MeCOEt/isoPrOH/Me2CO/H2O, 20/10/7/6 (v/v). Tiến hành cạo vùng chứa vết chất ra khỏi bản mỏng và hòa tan chất bằng dung môi MeOH. Các đường được thu hồi bằng cách loại bỏ cặn SiOH và bay hơi dung môi MeOH. Đo độ quay cực của đường thu được [113].
2.4.5. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro.
a. Phương pháp MTS
Phép thử này được thực hiện theo quy trình của GregorMalich và cộng sự [80]. Phương pháp MTS dựa trên nguyên lí chuyển đổi muối tetrazolium thành formazan hòa tan, có màu. Lượng formazan được tạo ra dưới tác dụng của enzym dehydrogenase tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống trong môi trường nuôi cấy và có thể đo được ở bước sóng 490 nm.
Các tế bào ung thư được nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 có bổ sung 10 % huyết thanh bào thai bũ (FBS), 100 U/mL penicillin và 100 àg/mL streptomycin ở 37 ºC trong tủ ấm 5 % CO2. Các tế bào được cấy chuyển vào phiến 96 giếng (mật độ tế bào 1×105 tế bào/giếng) và xử lý với nồng độ mẫu thử xác định trong DMSO. Sau 48 giờ ủ, môi trường nuôi cấy được loại bỏ một cách cẩn thận, dung dịch MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4- sulfophenyl)-2H-tetrazolium) được thêm vào các giếng trong 01 giờ. Formazan hòa tan được tạo ra bởi quá trình khử MTS được định lượng bằng cách đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 490 nm bởi máy đọc Infinite M200 (Tecan, Grodig, Austria). Thí nghiệm được thực hiện 03 lần ở mỗi nồng độ. Irinotecan hydrochloride được sử
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
dụng làm đối chứng dương.
Tỷ lệ tế bào sống sót (CS %) được tính theo công thức (1).
CS % = [OD (mẫu thử) – OD (ngày 0)]
x 100 (1) [OD (DMSO) – OD (ngày 0)]
Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử được xác định thông qua công thức (2).
% ức chế = 100% - [OD (mẫu thử) – OD (ngày 0)]
(2) [OD (DMSO) – OD (ngày 0)]
b. Phương pháp SRB
Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Skekan et al. (1990) [106]. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỷ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
- Các dòng tế bào ung thư ở người được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 1,5 g/L sodium bicarbonate, 4,5 g/L glucose, 10 mM HEPES và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10 % fetal bovine serum-FBS (Gibco). Tế bào được cấy chuyển sau 3 - 5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37 oC, 5 % CO2.
- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phự hợp với thớ nghiệm. Tiến hành đưa 190 àL tế bào vào đĩa 96 giếng để thử nghiệm.
- Mẫu thử được hòa tan trong DMSO 100 % để có nồng độ ban đầu (stock) là 20 mM. Tiến hành pha loãng mẫu trên đĩa 96 giếng bằng môi trường nuôi cấy tế bào (không có FBS) thành 04 dãy nồng độ từ cao xuống thấp. Chất thử đã pha loãng ở các nồng độ (10 L) được đưa vào các giếng của đĩa 96 giếng đã chuẩn bị tế bào ở trên. Giếng không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (190 L) + DMSO 1 % (10 L) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố định bằng Trichloracetic acid - TCA 20 %.
- Ủ trong tủ ấm 72 giờ. Sau 72 giờ, môi trường được gạn bỏ cẩn thận. Tế bào được cố định bằng TCA trong 01 giờ và được rửa với nước. Các tế bào sau đó được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 oC, rửa 03 lần bằng acetic acid rồi để khô ở nhiệt độ phòng.
- Hòa tan lượng SRB bằng 10 mM unbuffered Tris base, lắc nhẹ trong 10 phút rồi đọc kết quả OD ở bước sóng 540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Biotek).
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
- Phép thử được lặp lại 03 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine được sử dụng như là chất đối chứng dương, DMSO 1 % được sử dụng là chất đối chứng âm.
- Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử được xác định thông qua công thức (2).
Xử lí số liệu:
- Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50 % sự phát triển) sẽ được xác định bởi phần mềm TableCurve 2Dv4.
- Theo tiêu chuẩn của Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI), cao chiết được coi có hoạt tính tốt với IC50 20 μg/ml, trong khi chất tinh khiết được coi có hoạt tính tốt khi IC50 5 μM [39].
2.4.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính diệt nhuyễn thể
Thử nghiệm hoạt tính diệt nhuyễn thể được thực hiện theo phương pháp của Ding và cộng sự [22]. Mẫu thử được hòa tan trong 4 mL DMSO (dung dịch chuẩn gốc 1 %) và được đưa vào cốc có sẵn 20 con ốc với 150 mL nước cất. Mẫu thử được thử nghiệm với dãy nồng độ 100; 50; 25; 12,5; 6,0; 3,0 và 1,5 μg/mL. Saponin và DMSO lần lượt là đối chứng dương và đối chứng âm của thử nghiệm và được tiến hành tương tự, trong đó đối chứng dương được thực hiện với dãy nồng độ 50;
25; 12,5; 6,0; 3,0 và 1,5 μg/mL. Các cá thể không được cho ăn trong quá trình thử nghiệm. Thí nghiệm được lặp lại 04 lần ở mỗi nồng độ với điều kiện thí nghiệm ở nhiệt độ 25 ± 2 oC, độ ẩm 70 ± 5 %, chu kì quang 12:12 giờ (sáng:tối).
Sau 24 giờ, chuyển ốc sang các cốc chứa sẵn 150 mL nước cất để theo dõi sự phục hồi của ốc. Sau 24 giờ tiếp theo, những con ốc không phục hồi (bất động, không bám vào thành cốc và không thể rụt đầu vào trong vỏ khi bị một vật đầu tù đẩy nhẹ) được cho là đã chết. Số lượng ốc chết/sống được ghi nhận.
Giá trị nồng độ gây chết 50 % (LC50) được tính toán thông qua phép phân tích log-probit, sử dụng phần mềm SPSS25 với độ tin cậy 95 %.
2.4.7. Phương pháp thử độc tính cấp trên chuột
Độc tính cấp trên chuột được thử nghiệm dựa theo tài liệu của tác giả Đỗ Trung Đàm [2]. Ngưng cung cấp thức ăn cho chuột trong 15 giờ trước khi thử nghiệm, chuột được uống nước theo nhu cầu. Hòa tan mẫu thử bằng nước cất với nồng độ xác định, dung dịch mẫu thử được đưa thẳng vào dạ dày chuột bằng kim cong đầu tù với lượng thuốc uống mỗi lần 0,3 mL/10 g cân nặng, 03 lần/24 giờ, mỗi lần cách nhau ít nhất 03 giờ. Nhóm đối chứng được thực hiện tương tự với nước cất.
Thử nghiệm sơ bộ: chọn 02 con chuột cho uống liều khảo sát (dựa trên tài liệu tham khảo), quan sát chuột trong 72 giờ.
- Trường hợp 1: nếu không có chuột nào tử vong, tiếp tục thử nghiệm chính thức.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
- Trường hợp 2: nếu tất cả chuột tử vong thì giảm liều đến khi tìm được liều sao cho tỷ lệ sống/chết là 1/1, từ đó xác định dãy nồng độ thử nghiệm chính thức. Thử nghiệm chính thức được thực hiện ở 06 nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ thử trên 10 con chuột.
Theo dõi tình trạng chung của chuột và số lượng chuột chết mỗi lô trong vòng 72 giờ. Sau đó tiếp tục theo dõi tình trạng của chuột đến hết ngày thứ 07 sau khi uống thuốc. Ghi nhận số con chuột sống/chết sau thử nghiệm. Liều gây chết trung bình (LD50) được xác định thông qua phép phân tích log-probit, sử dụng phần mềm SPSS25 với độ tin cậy 95 %.
2.4.8. Phương pháp thử độc tính cấp trên tôm nước mặn
Phương pháp thử độc tính cấp trên tôm nước mặn được tiến hành dựa trên quy trình thử nghiệm của Cong và cộng sự [16]. Các mẫu thử được hòa tan bằng DMSO (dung dịch chuẩn gốc 1 %), sau đó được hòa tan trong dung dịch nước cất có chứa 3,5 % NaCl (Dung dịch 1). Hai mươi cá thể tôm nước mặn trưởng thành được cho vào cốc chứa sẵn 150 mL Dung dịch 1. Thí nghiệm được thực hiện ở các nồng độ 300; 250; 200; 150; 100; 50; 25 μg/mL. Đối chứng âm (bao gồm 1 % DMSO và 3,5 % NaCl trong nước cất) được thực hiện tương tự. Các cá thể không được cho ăn trong quá trình thử nghiệm. Thí nghiệm được lặp lại 04 lần ở mỗi nồng độ với điều kiện thí nghiệm ở nhiệt độ 25 ± 2 oC, độ ẩm 70 ± 5 %, chu kì quang 12:12 giờ (sáng:tối).
Sau 24 giờ, số lượng cá thể chết/sống được ghi nhận. Những cá thể ngừng di chuyển trong vòng 10 giây kể từ khi bị tác động nhẹ bởi vật đầu tù được xác định là đã chết.
Giá trị nồng độ gây chết trung bình (LC50) được tính toán thông qua phép phân tích log-probit, sử dụng phần mềm SPSS25 với độ tin cậy 95 %.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế