4.1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập
4.1.1. Các hợp chất mới
a. Hợp chất AL-04: oleanolic acid-[28-O-β-D-glucopyranosyl]-3-O-{[6'''-O- β-D-glucopyranosyl-(3''-O-β-D-glucopyranosyl)]-(4''-O-α-L-
arabinofuranosyl)-β-D-glucuronopyranoside (araliaarmoside)
Hợp chất AL-04 thu được có dạng bột vô định hình, màu trắng. Độ quay cực
25D: +13,0° (c 0,1, MeOH). Công thức phân tử của AL-04 được dự đoán là C59H94O28 bởi phổ HR-ESI-MS xuất hiện peak ion giả phân tử proton hóa ở m/z 1249,5860 [M-H]- (Tính toán lý thuyết cho công thức phân tử tương ứng là C59H93O28: 1249,5853) (Hình 4.1) và kết hợp dữ liệu các phổ 13C-NMR, DEPT.
Phổ 1H NMR, 13C NMR kết hợp phổ HSQC của hợp chất AL-04 cho thấy sự xuất hiện tín hiệu của 07 nhóm methyl với độ chuyển dịch hóa học lần lượt là δH
0,82/ δC 17,8; δH 0,85/ δC 17,0; δH 0,93/ δC 33,4; δH 0,96/ δC 24,0; δH 0,96/ δC 16,0;
δH 1,05/ δC 28,5; δH 1,17/ δC 26,2; 01 liên kết đôi ‒C=CH< tại δH 5,27 (br s)/ δC
123,8 và δC 144,8; 05 gốc đường được nhận biết bởi các tín hiệu anomeric tại δH
4,36 (1H, d, J = 7,5 Hz)/ δC 106,3; δH 4,37 (1H, d, J = 7,5 Hz)/ δC 104,6; δH 4,87 (1H, d, J = 8,0 Hz)/ δC 104,4; δH 5,37 (1H, d, J = 8,0 Hz)/ δC 95,7; δH 5,20 (1H, br s)/ δC 108,3; 01 nhóm carbonyl tại δC 178,1 (Hình 4.2, 4.3 và 4.7).
Các giá trị độ chuyển dịch của H-3 (δH 3,15)/ C-3 (δC 90,7), tương tác HMBC giữa H3-23 (δH 1,05)/ H3-24 (δH 0,85) và C-3/ C-4 (δC 40,1)/ C-5 (δC 57,0) gợi ý carbon tại C-3 bị oxy hóa (Hình 4.5 và 4.6).
Tương tác HMBC giữa H3-27 (δH 1,17) và C-13 (δC 144,8), các tương tác trên phổ 1H-1H COSY giữa H-9 (δH 1,59)/ H2-11 (δH 1,90)/ H-12 (δH 5,27) cùng với độ chuyển dịch của C-12 (δC 123,8) một lần nữa khẳng định liên kết đôi tại C-12/ C-13 (Hình 4.5 và 4.10A).
Phổ 13C NMR và DEPT của hợp chất AL-04 cho tín hiệu của 59 nguyên tử carbon bao gồm 09 carbon không mang proton, 29 nhóm methine, 14 nhóm methylene và 07 nhóm methyl (Hình 4.3 và 4.4).
Những đặc trưng này cùng với sự trùng khớp dữ liệu NMR giữa hợp chất AL- 04 (Bảng 4.1) và các hợp chất triterpene saponin loại oleanane từ tài liệu tham khảo [38] cho thấy hợp chất AL-04 có khung oleanane.
Tín hiệu của 29 carbon còn lại cùng với 05 tín hiệu anomeric gợi ý phần đường có 04 đơn vị hexose và 01 đơn vị pentose.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
Hình 4.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất AL-04.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
Anomeric proton
5.4 5.3 5.2 5.1 5.0 4.9 4.8 4.7 4.6 4.5 4.4 4.3
5.377 5.361 5.265 5.205 4.881 4.865 4.834 4.402 4.394 4.384 4.373 4.369 4.357 4.354
Hình 4.2. Phổ 1H NMR của hợp chất AL-04.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
‒C=C<
>C=O
‒O‒C<
Hình 4.3. Phổ 13C NMR của hợp chất AL-04.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
Hình 4.4. Phổ DEPT của hợp chất AL-04.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
C-28 C-1'''' C-3 C-3''
H-1''' H-1'
H-3 H-4''
H-27H-23 H-24 C-13 C-1'' C-1'''''
H-6''' H-6'''
Hình 4.5. Phổ HMBC của hợp chất AL-04.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
C-5
H-23
H-24
C-4
Hình 4.6. Phổ HMBC giãn của hợp chất AL-04.
Tín hiệu carbon tại δC 176,5 gợi ý sự hiện diện của glucuronic acid monosaccharide [10], điều này được khẳng định bởi tín hiệu anomeric δC 106,3/ δH
4,36 (d, J = 7,5 Hz), các tương tác HSQC giữa các carbon/proton (Cʹʹ/Hʹʹ) tương ứng (δC 75,3/ δH 3,85; δC 76,4/ δH 3,55; δC 78,4/ δH 3,68; δC 82,1/ δH 3,75 (Hình 4.8 và 4.9) và các tương tác COSY giữa H-1ʹʹ (δH 4,36)/ H-2ʹʹ (δH 3,55)/ H-3ʹʹ (δH 3,75)/
H-4ʹʹ (δH 3,85)/ H-5ʹʹ (δH 3,68) (Hình 4.10A).
Tín hiệu trường thấp của anomeric carbon δC 108,3, tín hiệu trường cao của anomeric proton δH 5,20 (br s) cùng với các tương tác δC 63,3/ δH 3,64 và 3,69; δC
79,3/ δH 3,80; δC 81,9/ δH 4,01; δC 87,1/ δH 4,39; δC 108,3/ δH 5,20 trên phổ HSQC đặc trưng cho nhóm arabinofuranosyl [10] (Hình 4.8 và 4.9).
Một đường glucopyranose được khẳng định bởi bộ tín hiệu đặc trưng với độ chuyển dịch của carbon từ C-1ʹ đến C-6ʹ là δC 95,7; 73,8; 78,1; 71,0; 77,9 và 62,2;
tương ứng với các tín hiệu proton từ H-1ʹ đến H-6ʹ trên phổ HSQC tại δH 5,37 (d, J
= 8,0 Hz), 3,35; 3,43; 3,44; 3,31; 3,70/3,82 [92] (Hình 4.8 và 4.9).
Các tương tác HMBC giữa H-3 (δH 3,15)/ GluA C-1ʹʹ (δC 106,3), giữa GluA H-4ʹʹ (δH 3,85) và Ara(f) C-1ʹʹʹʹ (δC 108,3), giữa Glc H-1ʹ (δH 5,37) và C-28 (δC
178,1) (Hình 4.5), các tương tác NOESY giữa H-3 (δH 3,15) và GluA H-1ʹʹ, Ara(f) H-1ʹʹʹʹ (δH 5,20) và GluA H-4ʹʹ, xác định liên kết arabinofuranosyl-(1→4)- glucuronopyranoside và gốc đường glucuronopyranoside liên kết với C-28 của phần aglycone (Hình 4.10B). So sánh dữ liệu phổ NMR của hợp chất AL-04 với hợp
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
chất 3-O-α-L-arabinofuranosyl-(1→4)-β-D-glucuronopyranosylhederagenin 28-O- β-D-glucopyranosyl ester, ta thấy khá phù hợp [10].
C-24 C-25 C-26
C-29 C-27 C-23 C-30
H -2 7 H -2 3 H -2 9/ H -2 5 H -3 0 H -2 4 H -2 6
Hình 4.7. Phổ HSQC giãn (15-60 ppm, 0,5-3 ppm) của hợp chất AL-04.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
C -1 '
C -1 ''' C -1 ''' '' C -1 '' C -1 ''' '
C -1 2
H-1'
H-1'''
H-1''''' H-1''
H-1'''' H-12
Hình 4.8. Phổ HSQC giãn (85-125 ppm, 4,3-5,4 ppm) của hợp chất AL-04.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
Hình 4.9. Phổ HSQC giãn (60-92 ppm, 3,1-4,5 ppm) của hợp chất AL-04.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
H-11
H-12 H-9
H-1'' H-2''
H-3'' H-4''
H-5''
5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 ppm
5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 ppm
H-3
H-1''
H-1'''' H-4'' H-1''''' H-6'''
H-1''' H-3''
2.0 ppm
5.0 4.0 3.0 1.0
1.0
4.0 3.0 2.0
5.0 ppm
H-5
(A)
(B)
Hình 4.10. Phổ COSY (A) và NOESY (B) của hợp chất AL-04.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
Bộ tín hiệu δC 69,5/ δH 3,78 và 4,14; δC 71,1/ δH 3,25, δC 75,6/ δH 3,27; δC
77,8/ δH 3,53; δC 78,5/ δH 3,70; δC 104,4/ δH 4,87 (d, J = 8,0 Hz) và bộ tín hiệu δC
62,7/ δH 3,70 và 3,83; δC 71,5/ δH 3,21; δC 75,1/ δH 3,22; δC 77,8/ δH 3,30; δC 78,1/
δH 3,25; δC 104,6/ δH 4,37 (d, J = 7,5 Hz) trên phổ NMR và HSQC cho thấy đặc trưng của hai gốc đường glucopyranose [92] (Hình 4.8 và 4.9). Phần đường glucopyranosyl-(1→6)-glucopyranoside liên kết với C-3ʹʹ của glucuronopyranosyl được khẳng định bởi tương tác HMBC giữa Glc H6ʹʹʹ (δH
3,78 và 4,14)/ Glc C-1ʹʹʹʹʹ (δC 104,6) và Glc H-1ʹʹʹ (δH 4,87)/ GluA C-3ʹʹ (δC 82,1), tương tác NOESY giữa Glc H1ʹʹʹʹʹ/ Glc H-6ʹʹʹ (δH 3,78) và Glc H-1ʹʹʹ/ GluA H-3ʹʹ (δH 3,75) (Hình 4.5, 4.10B).
Hằng số ghép (J = 7,5 - 8,0 Hz) của các proton thuộc các gốc đường GluA và Glc trong phổ 1H NMR của hợp chất AL-04 chỉ ra rằng các liên kết đường này ở dạng β; proton của gốc Ara (H-1ʹʹʹ) dạng singlet rộng gợi ý liên kết đường này có cấu hình α [97].
Proton H-3 được xác định là dạng axial dựa vào hằng số ghép J lớn của H-3 (JH-2/H-3 = 12,0 Hz), điều này phù hợp với sự sinh tổng hợp khung oleanane [34]. Tương tác NOESY (Hình 4.10B) giữa H-5 (δH 0,79) và Hα-3 (δH 3,15) khẳng định định hướng β của nhóm bị oxy hóa tại C-3 và định hướng α của H-5.
Các đường này được xác định là đường D-glucuronic acid, D-glucose và L-arabinose bằng cách thủy phân, phân tách các đường bằng sắc ký bản mỏng điều chế. Độ quay cực ( 25D, c 0,05, H2O) của các đường được xác định lần lượt là +9,8; +41,6; +74,5 và được so sánh độ quay cực của các đường chuẩn đã công bố [8, 9, 48, 88, 98, 111]. Ngoài ra, các đường còn được xác định bằng cách thủy phân, chuyển hóa thành dẫn xuất thiazolidine, phân tích HPLC và so sánh thời gian lưu của đường chuẩn [110].
Từ những dữ kiện phổ trên, hợp chất AL-04 được đề xuất tên gọi là oleanolic acid-[28-O-β-D-glucopyranosyl]-3-O-{[6'''-O-β-D-glucopyranosyl-(3''-O-β-D- glucopyranosyl)]-(4''-O-α-L-arabinofuranosyl)-β-D-glucuronopyranoside (hay oleanolic acid-[28-O-β-D-glucopyranosyl]-3-O-[β-D-glucopyranosyl(1→6)-β-D glucopyranosyl](1→3)[α-L-arabinofuranosyl(1→4)]-β-D-glucuronopyranoside)) (Hình 4.11). Tra cứu trên cơ sở dữ liệu Scifinder, cho phép xác định đây là hợp chất mới và được đặt tên là araliaarmoside.
Hình 4.11. Cấu trúc hóa học (A) và tương tác HMBC, COSY chính (B) của hợp chất AL-04.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
Bảng 4.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất AL-04.
C a,bδC a,cδH (J, Hz) C a,bδC a,cδH (J, Hz) 1 39,8 0,97 (m)/1,60 (m) 2ʹ 73,8 3,35 (dd, 9,0; 8,0) 2 26,9 1,69 (m)/1,90 (m) 3ʹ 78,1 3,43 (t, 9,0) 3 90,7 3,15 (dd, 4,0; 12,0) 4ʹ 71,0 3,44 (t, 9,0)
4 40,1 - 5ʹ 77,9 3,31 (m)
5 57,0 0,79 (m) 6ʹ 62,2 3,70 (m)/3,82 (m)
6 19,3 1,40 (m)/1,52 (m) 3-O-GluA
7 33,9 1,31 (m)/1,51 (m) 1ʹʹ 106,3 4,36 (d, 7,5)
8 40,8 - 2ʹʹ 76,4 3,55 (dd, 9,0; 7,5)
9 49,0 1,59 (m) 3ʹʹ 82,1 3,75 (t, 9,0)
10 37,9 - 4ʹʹ 75,3 3,85 (t, 9,0)
11 24,5 1,90 (m) 5ʹʹ 78,4 3,68 (d, 9,0)
12 123,8 5,27 (br s) 6ʹʹ 176,5 -
13 144,8 - 3ʹʹ-O-Glc
14 42,9 - 1ʹʹʹ 104,4 4,87 (d, 8,0)
15 28,9 1,10 (m)/1,80 (m) 2ʹʹʹ 75,6 3,27 (dd, 9,0; 8,0) 16 24,0 1,71 (m)/2,05 (m) 3ʹʹʹ 78,5 3,70 (t, 9,0)
17 48,0 - 4ʹʹʹ 71,1 3,25 (t, 9,0)
18 42,5 2,88 (dd, 3,0; 14,0) 5ʹʹʹ 77,8 3,53 (m) 19 47,2 1,19 (m)/1,71 (m) 6ʹʹʹ 69,5 3,78 (d, 12,0)
4,14 (d, 12,0)
20 31,5 - 4ʹʹ-O-Ara(f)
21 34,8 1,22 (m)/1,41 (m) 1ʹʹʹʹ 108,3 5,20 (br s) 22 33,2 1,61 (m)/1,75 (m) 2ʹʹʹʹ 81,9 4,01 (d, 1,5) 23 28,5 1,05 (s) 3ʹʹʹʹ 79,3 3,80 (dd, 1,5; 8,5)
24 17,0 0,85 (s) 4ʹʹʹʹ 87,1 4,39 (m)
25 16,0 0,96 (s) 5ʹʹʹʹ 63,3 3,64 (dd, 12,0; 4,0) 3,69 (dd, 12,0; 4,0)
26 17,8 0,82 (s) 6ʹʹʹ-O-Glc
27 26,2 1,17 (s) 1ʹʹʹʹʹ 104,6 4,37 (d, 7,5)
28 178,1 - 2ʹʹʹʹʹ 75,1 3,22 (dd, 9,0; 7,5)
29 24,0 0,96 (s) 3ʹʹʹʹʹ 77,8 3,30 (t, 9,0) 30 33,4 0,93 (s) 4ʹʹʹʹʹ 71,5 3,21 (t, 9,0)
28-O-glc 5ʹʹʹʹʹ 78,1 3,25 (m)
1ʹ 95,7 5,37 (d, 8,0) 6ʹʹʹʹʹ 62,7 3,70 (m)/3,83 (m)
Đo trong a)CD3OD, b)125 MHz, c)500 MHz. Tín hiệu được xác định trên phổ DEPT, HSQC, HMBC, COSY và NOESY. Glc: β-D-glucopyranosyl, GluA: β-D-glucuronopyranosyl, Ara(f): α-L- arabinofuranosyl.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
b. Hợp chất AL-09: 3β,23α-dihydroxyolean-12-ene-28-oic acid 3-O-[4'-O-α- L-arabinofuranosyl-(3'-O-β-D-glucopyranosyl)]-β-D-glucuronopyranoside (aramatoside B)
Hợp chất AL-09 thu được dưới dạng bột vô định hình, màu trắng. Trên phổ HR-ESI-MS của hợp chất AL-09 (Hình 4.12) xuất hiện hai peak ion tại m/z 941,4768 [M ‒ H]- (Tính toán lý thuyết cho công thức phân tử tương ứng là C47H73O19: 941,4746), m/z 977,4536 [M + 35Cl]- (Tính toán lý thuyết cho công thức phân tử tương ứng là C47H74O1935Cl: 977,4513), kết hợp với dữ liệu các phổ 13C- NMR và DEPT, có thể đề nghị công thức phân tử của hợp chất AL-09 là C47H74O19.
Phổ 1H NMR của hợp chất AL-09 xuất hiện tín hiệu của 06 nhóm methyl dạng singlet [δH 0,71; 0,88; 0,90; 0,97; 0,99; 1,17 (3H, s)], 01 proton olefin dạng broad singlet [δH 5,23 (1H, br s)] (Hình 4.13).
Phổ 13C NMR và DEPT (Hình 4.14 và 4.15) cho tín hiệu của 47 nguyên tử carbon bao gồm 09 carbon không mang proton, 19 nhóm methine, 13 nhóm methylene và 06 nhóm methyl. Tín hiệu hai carbon tại δC 181,0 và 176,6 gợi ý 02 nhóm carbonyl. Hai carbon olefinic tại δC [146,6 (C) và 122,6 (CH)] gợi ý sự xuất hiện nối đôi C=C. Ba carbon anomeric tại δC 104,6; 105,0 và 108,3 gợi ý sự có mặt của ba đơn vị đường monosaccharide.
Các tín hiệu trên phổ 1H NMR và 13C NMR của hợp chất AL-09, kết hợp so sánh dữ liệu phổ NMR của hợp chất AL-04 (Bảng 4.2, Phụ lục 26), ta thấy khá trùng khớp ở phần aglycone. Như vậy, có thể khẳng định hợp chất AL-09 có khung oleanane. Bên cạnh đó, các giá trị độ chuyển dịch của H-3 (δH 3,64) và C-3 (δC
83,1), tương tác HMBC giữa H3-23 (δH 3,62)/ H3-24 (δH 0,71) và C-3/ C-4 (δC
43,9)/ C-5 (δC 48,2) chỉ ra carbon tại C-3 bị oxy hóa. Tương tác HMBC giữa H-16 (δH 1,90) và C-28 (δC 181,0) chỉ ra nhóm carboxylic tại C-28. Độ chuyển dịch của carbon/proton của C-23/ H-23 tại δC 65,0/ δH 3,28 và 3,62; cùng tương tác HMBC giữa H3-24 (δH 0,71) và C-3 (δC 83,1)/ C-4 (δC 43,9)/ C-5 (δC 48,2)/ C-23 (δC 65,0) (Hình 4.16) chỉ ra sự hiện diện của nhóm hydroxyl tại C-23. Do đó, phần aglycone của hợp chất AL-09 được khẳng định là 3,23-dihydroxyolean-12-ene-28-oic acid.
Tín hiệu của 17 carbon gợi ý 03 đơn vị đường, trong đó có hai đường 06 carbon và một đường 05 carbon. Dữ liệu NMR của phần đường của hợp chất AL-09 gần như giống với các gốc đường glucopyranoside, glucuronopyranoside và arabinofuranoside của hợp chất AL-04.
Tương tác HMBC giữa Glc H-1'' (δH 4,84) và GluA C-3′ (δC 82,7), Ara H-1''' (δH 5,20) và GluA C-4′ (δC 75,2), GluA H-1′ (δH 4,47) và aglycone C-3 (δC 83,1) (Hình 4.17) lần lượt khẳng định nhóm O-glucopyranosyl liên kết với C-3′ và nhóm O-arabinofuranosyl liên kết tại C-4′ của glucuronopyranosyl và nhóm O- glucuronopyranosyl liên kết với C-3 của aglycone. So sánh với hợp chất AL-04, ta thấy khá phù hợp.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
100
Count vs. Mass-to-charge (m/z)
200 300 400 500
941.4768
977.4536
1077.4521 867.4497
809.4311 679.4064
442.8947 281.1378
213.1503 102.9571
157.0131
600 700 800 900 1000 1100 1200 1300
3.2
0 0.4 x 104
0.8 1.2 2.0
1.6 2.4 2.8 3.6
Hình 4.12. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất AL-09.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
Hình 4.13. Phổ 1H NMR của hợp chất AL-09.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
47 Carbon
Hình 4.14. Phổ 13C NMR của hợp chất AL-09.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
19 >CH-
6 –CH3 13 –CH2–
9 >C<
Hình 4.15. Phổ DEPT của hợp chất AL-09.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
C-28
H -1 6
C-3 C-23 C-4 C-5
H -2 4
H -2 3
Hình 4.16. Phổ HMBC của hợp chất AL-09.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
H -1 ''
C-4'
H -1 ''' H -1 '
C-3' C-3
Hình 4.17. Phổ HMBC giãn của hợp chất AL-09.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
H-3 H-5
H-23 H-25 H-24
1.0 ppm
1.5 2.0
2.5 3.0
3.5 1.0
1.5
2.0
2.5 3.0
3.5 ppm
Hình 4.18. Phổ NOESY của hợp chất AL-09.
Giá trị hằng số tương tác J của anomeric proton GluA H-1′ (d, J = 8,0 Hz), Glc H-1'' (d, J = 8,0 Hz) và Ara H-1''' (br s) gợi ý các gốc đường lần lượt có dạng là β-glucuronopyranosyl, β-glucopyranosyl và α-arabinofuranosyl [97]. Các đường này được xác định là đường D-glucuronic acid, D-glucose và L-arabinose như hợp chất AL-04.
Dựa trên sự sinh tổng hợp khung oleanane [34] và độ chuyển dịch hóa học tại C-3/H-3 của hợp chất AL-09 và AL-04 khá trùng khớp, proton H-5 được xác định có cấu hình α. Tương tác NOESY giữa H3-24 (δH 0,71) và H3-25 (δH 0,99), H- 5 (δH 1,25) và H2-23 (δH 3,62)/ H-3 (δH 3,64) (Hình 4.18) chỉ ra rằng nhóm methyl C-24 và C-25 có định hướng β trong khi proton H-3, H-5 và nhóm hydroxymethylene (C-23) có định hướng α.
Căn cứ vào các dữ kiện trên, hợp chất AL-09 được đề xuất tên gọi là 3β,23α- dihydroxyolean-12-ene-28-oic acid 3-O-[4'-O-α-L-arabinofuranosyl-(3'-O-β-D- glucopyranosyl)]-β-D-glucuronopyranoside. Tra cứu trên cơ sở dữ liệu Scifinder, cho phép xác định đây là hợp chất mới và được đặt tên là aramatoside B (Hình 4.19).
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
(A) (B)
HMBC COSY
Hình 4.19. Cấu trúc hóa học (A) và tương tác HMBC, COSY chính (B) của hợp chất AL-09.
Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất AL-09.
C a,bδC a,cδH (J, Hz) C a,bδC a,cδH (J, Hz) 1 39,5 0,96 (m)/1,60 (m) 26 18,3 0,88 (s) 2 26,3 1,73 (m)/1,91 (m) 27 26,5 1,17 (s)
3 83,1 3,64 (m) 28 181,0 -
4 43,9 - 29 33,9 0,90 (s)
5 48,2 1,25 (m) 30 24,3 0,97 (s)
6 19,0 1,39 (m)/1,49 (m) 3-O-GluA
7 33,6 1,29 (m)/1,61 (m) 1' 105,0 4,47 (d, 8,0)
8 40,5 - 2' 76,1 3,55 (dd, 8,0; 9,0)
9 49,0 1,64 (m) 3' 82,7 3,77 (t, 9,0)
10 37,7 - 4' 75,2 3,84 (t, 9,0)
11 24,5 1,92 (m) 5' 78,3 3,72 (m)
12 122,6 5,23 (br s) 6' 176,6 -
13 146,6 - 3'-O-Glc
14 43,1 - 1'' 104,6 4,84 (*) (d, 8,0)
15 29,2 1,01 (m)/1,89 (m) 2'' 75,6 3,28 (dd, 8,0; 9,0) 16 24,6 1,61 (m)/1,90 (m) 3'' 78,0 3,37 (t, 9,0)
17 48,2 - 4'' 71,1 3,35 (t, 9,0)
18 43,4 2,92 (dd, 3,5; 15,5) 5'' 78,3 3,26 (m)
19 48,0 1,11 (m)/1,69 (m) 6'' 62,2 3,71 (*)/3,84 (br d, 12,0)
20 31,8 - 4'-O-Ara(f)
21 35,6 1,17 (m)/1,37 (m) 1''' 108,3 5,20 (br s) 22 34,3 1,51 (m)/1,76 (m) 2''' 82,0 4,02 (br s) 23 65,0 3,28 (m)/3,62 (m) 3''' 79,4 3,80 (br d, 2,5)
24 13,4 0,71 (s) 4''' 87,1 4,39 (m)
25 16,5 0,99 (s) 5''' 63,3 3,64 (*) (dd, 4,0; 12,0) 3,70 (dd, 4,0; 12,0)
(*) Tín hiệu lồng chập. Đo trong a)CD3OD, b)125 MHz, c)500 MHz. Tín hiệu được xác định trên phổ DEPT, HSQC, HMBC, COSY và NOESY. GluA: β-D-glucuronopyranosyl, Glc: β-D- glucopyranosyl, Ara(f): α-L-arabinofuranosyl.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
c. Hợp chất AL-12: 3β,22α-dihydroxyolean-12-ene-28-oic acid 3-O-[4'-O-α-L- arabinofuranosyl-(3'-O-β-D-glucopyranosyl)]-β-D-glucuronopyranoside
(aramatoside A)
Hợp chất AL-12 có dạng bột vô định hình, màu trắng. Công thức phân tử của AL-12 được dự đoán là C47H74O19 bởi sự xuất hiện các tín hiệu trên phổ HR-ESI- MS (Hình 4.20) tại m/z 941,4767 [M - H]- và m/z 977,4533 [M + Cl]- (Tính toán lí thuyết cho các công thức phân tử tương ứng là C47H73O19: 941,4746, C47H74O1935Cl:
977,4513), kết hợp dữ liệu các phổ 13C-NMR và DEPT. Có thể thấy rằng, hợp chất AL-12 và AL-09 có cùng công thức phân tử.
Bên cạnh đó, hợp chất AL-12 có các tín hiệu phổ (Hình 4.21 – 4.24) cũng như dữ liệu NMR gần như giống với hợp chất AL-09 về cả phần aglycone và phần đường (Bảng 4.3, Phụ lục 27). Tuy nhiên, có sự khác biệt tại C-22 và C-23 giữa hợp chất AL-09 và AL-12.
Đối với hợp chất AL-12, các đỉnh chéo trong phổ COSY giữa H-18 (δH
2,84)/ H2-19 (δH 1,11 và 1,74), H2-21 (δH 1,41 và 1,39)/ H-22 (δH 3,86) (Hình 4.23A); tương tác HMBC giữa H3-29 (δH 0,96)/ H3-30 (δH 1,01) và C-19 (δC 46,9)/
C-20 (δC 32,1)/ C-21 (δC 42,9) (Hình 4.24) và độ chuyển dịch hóa học của C-22 (δC
72,5) cho thấy carbon tại C-22 bị oxy hóa.
Tín hiệu singlet của H-23 tại δH 1,06, giá trị độ chuyển dịch của C-23 tại δC
28,5, các tương tác HMBC giữa H-23 và C-4 (δC 40,2)/ C-5 (δC 57,0)/ C-24 (δC
17,0) của hợp chất AL-12 chứng tỏ tại C-23 là methyl thay vì nhóm CH2–OH ở hợp chất AL-09 (Hình 4.24).
Hằng số ghép J lớn của H-3 (JH-2/H-3 = 12,0 Hz) xác định H-3 có dạng axial. Do đó, nhóm thế tại C-3 có định hướng β và H-5 có định hướng α được suy ra từ tương tác NOESY giữa H-5 (δH 0,79) và H-3 (δH 3,14), điều này phù hợp với sự sinh tổng hợp khung oleanane [34]. Proton tại δH 2,84 ppm đặc trưng cho Hα-18 [28, 32], sự xuất hiện tương tác NOESY giữa H-18 (δH 2,84) và H-22 (δH 3,86) cho thấy định hướng α của nhóm hydroxyl tại C-22 (Hình 4.23B).
Các đường của hợp chất AL-12 được xác định là đường D-glucuronic acid, D-glucose và L-arabinose như hợp chất AL-04.
Dựa vào lập luận trên, có thể khẳng định hợp chất AL-12 có cấu trúc hóa học như Hình 4.25, với tên đề xuất là 3β,22α-dihydroxyolean-12-ene-28-oic acid 3-O-[4'- O-α-L-arabinofuranosyl-(3'-O-β-D-glucopyranosyl)]-β-D-glucuronopyranoside. Tra cứu trên cơ sở dữ liệu Scifinder, cho phép xác định đây là hợp chất mới và được đặt tên là aramatoside A.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
Count vs. Mass-to-charge (m/z)
941.4767
977.4533
102.9569 203.1289 306.9200 509.2271
578.8691 653.3322 807.4218 875.4415 1077.4547
1256.3033
100 200
0
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300
x 104
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Hình 4.20. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất AL-12.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
Hình 4.21. Phổ 1H NMR của hợp chất AL-12.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
>C=C- 2 >C=O
47 carbon
anomeric carbon
Hình 4.22. Phổ 1H NMR (A) và 13C NMR (B) của hợp chất AL-12.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
H-19
H-19
H-18
H-21
H-22
H-18
H-22 H-5
H-3
(A)
(B)
Hình 4.23. Phổ COSY (A) và NOESY (B) của hợp chất AL-12.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
C-24
H-30 H-29
H-23
C-4 C-20
C-21 C-19
C-5
Hình 4.24. Phổ HMBC của hợp chất AL-12.
(A) (B)
HMBC COSY
Hình 4.25. Cấu trúc hóa học (A) và tương tác HMBC, COSY chính (B) của hợp chất AL-12.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
Bảng 4.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất AL-12.
C a,bδC a,cδH (J, Hz) C a,bδC a,cδH (J, Hz) 1 39,8 0,98 (m)/1,60 (m) 26 17,9 0,86 (s) 2 26,9 1,68 (m)/1,90 (m) 27 26,8 1,19 (s) 3 90,9 3,14 (dd, 4,5; 12,0) 28 181,0 -
4 40,2 - 29 33,6 0,96 (s)
5 57,0 0,79 (m) 30 25,2 1,01 (s)
6 19,3 1,42 (m)/1,56 (m) 3-O-GluA
7 34,0 1,32 (m)/1,53 (m) 1' 106,3 4,37 (d, 8,0)
8 43,3 - 2' 76,5 3,56 (dd, 8,0; 9,0)
9 48,8 1,58 (m) 3' 82,1 3,77 (t, 9,0)
10 37,9 - 4' 75,4 3,86 (t, 9,0)
11 24,5 1,88 (m)/1,91 (m) 5' 78,3 3,69 (m)
12 123,7 5,26 (br s) 6' 176,5 -
13 144,6 - 3'-O-Glc
14 40,7 - 1'' 104,3 4,88 (d, 8,0)
15 28,5 1,11 (m)/1,90 (m) 2'' 75,6 3,27 (dd, 8,0; 9,0) 16 17,4 1,69 (m)/1,96 (m) 3'' 77,9 3,38 (t, 9,0)
17 53,6 - 4'' 71,1 3,36 (t, 9,0)
18 44,0 2,84 (dd, 4,0; 14,0) 5'' 78,2 3,28 (m)
19 46,9 1,11 (m)/1,74 (m) 6'' 62,2 3,71 (*)/3,83 (*)
20 32,1 - 4'-O-Ara
21 42,9 1,41 (m)/1,39 (m) 1''' 108,3 5,20 (br s)
22 72,5 3,86 (m) 2''' 81,9 4,02 (br s)
23 28,5 1,06 (s) 3''' 79,3 3,81 (br d, 3,0)
24 17,0 0,85 (s) 4''' 87,2 4,40 (m)
25 15,9 0,96 (s) 5''' 63,3 3,65 (dd, 5,5; 11,5)
3,70 (dd, 5,5; 11,5)
(*) Tín hiệu lồng chập. Đo trong a)CD3OD, b)125 MHz, c)500 MHz. Tín hiệu được xác định trên phổ DEPT, HSQC, HMBC, COSY và NOESY.
d. Hợp chất AR-04: 23-hydroxyoleanolic acid-[28-O-β-D-glucopyranosyl]- 3-O-[2''-O-β-D-glucopyranosyl-(3''-O-β-D-glucopyranosyl)]-β-D-
galactopyranoside (aramatoside C)
Hợp chất AR-04 thu được có dạng bột vô định hình, màu trắng. Độ quay cực
25D : +51,0° (c 0,1, MeOH). Công thức phân tử của AR-04 được đề nghị là C54H88O24 bởi phổ HR-ESI-MS (Hình 4.26) với peak ion giả phân tử proton hóa ở m/z 1155,5341 [M + 35Cl]- (Tính toán lý thuyết cho công thức phân tử tương ứng là C54H88O2435Cl: 1155,5354), m/z 1157,5289 [M + 37Cl]- (Tính toán lý thuyết cho công thức phân tử tương ứng làC54H88O24 37Cl: 1157,5325), kết hợp với dữ liệu các
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
phổ 13C-NMR và DEPT.
Phân tích phổ 1H NMR; 13C NMR kết hợp phổ HSQC của AR-04 chỉ ra sự xuất hiện 06 nhóm methyl (δH 0,76/δC 13,2; δH 1,00/ δC 16,4; δH 0,83/ δC 18,7; δH
1,19/ δC 26,4; δH 0,95/ δC 24,0 và δH 0,93/ δC 33,5); 01 liên kết đôi ‒C=CH< [δH
5,27 (t, J = 3,5 Hz)/ δC 123,8 và δC 144,9], 01 nhóm carbonyl (δC 178,1), 01 nhóm methine carbinol C-3 [δH 3,67 (dd, J = 13,5, 5,4 Hz)/ δC 84,9] và 04 gốc đường được nhận biết bởi các tín hiệu anomeric tại δH 5,40 (d, J = 8,0 Hz)/ δC 95,7; δH 4,53 (d, J = 7,5 Hz)/ δC 104,8; δH 4,89 (d, J = 7,5 Hz)/ δC 103,5; và δH 4,63 (d, J = 7,5 Hz)/ δC 105,3 (Hình 4.27 - 4.31). Các tín hiệu trên gợi ý hợp AR-04 thuộc hợp chất triterpene glycoside loại oleanane.
Để khẳng định điều này, dữ liệu NMR của hợp chất AR-04 được so sánh với hợp chất AL-04 (Bảng 4.4, Phụ lục 28). Kết quả cho thấy, phần aglycone của hai hợp chất gần giống nhau, các giá trị độ chuyển dịch sai lệch không đáng kể.
Hình 4.26. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất AR-04.
Sự so sánh này cũng cho thấy nhóm methyl tại C-23 của hợp chất AL-04 được thay thế bởi nhóm ‒CH2OH trong AR-04, điều này được xác nhận bởi những tín hiệu tại δH 3,78 và 3,28 (1H, d, J = 12,0 Hz)/ δC 64,8 cũng như sự vắng mặt của tín hiệu CH3-23 trong phổ NMR của AR-04. Ngoài ra, tương quan HMBC giữa H- 24 (δH 0,76) và C-23 (δC 64,8)/ C-3 (δC 84,9)/ C-4 (δC 44,2)/ C-5 (δC 48,0) chỉ ra rằng nhóm hydroxyl tại C-23 (Hình 4.32 và 4.33).
Như vậy, 24 carbon còn lại gợi ý 04 đơn vị hexose.
Đường galactopyranosyl được nhận ra bởi một loạt tín hiệu đặc trưng [58] tại δC 104,8/ δH 4,53 (d, J = 7,5 Hz) (C-1′′/H-1′′), δC 76,6/ δH 3,98 (C-2′′/H-2′′), δC 85,4/
δH 3,82 (C-3′′/H-3′′), δC 70,0/ δH 4,14 (C-4′′/H-4′′), δC 76,0/ δH 3,56 (C-5′′/H-5′′), δC
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
63,5/ δH 3,57 và 3,83 (C-6′′/H-6′′) trong phổ HSQC (Hình 4.29 và 4.31), tương tác COSY giữa H-1''/ H-2''/ H-3''/ H-4''/ H-5''/ H-6'' (Hình 4.34), cũng như sự xuất hiện của tín hiệu H-4′′ với peak đôi rộng và hằng số ghép nhỏ (J = 3,0 Hz). Đường galactose được gắn vào C-3, được xác nhận bằng tương quan HMBC giữa Gal H-1′′
(δH 4,53) và C-3 (δC 84,9), H-3 (δH 3,67) và Gal C-1′′ (δC 104,8) (Hình 4.32).
Phổ 1H NMR và HSQC cho 03 bộ tín hiệu: C'/H' (δC 62,5/ δH 3,70 và 3,84;
δC 71,2/ δH 3,35; δC 74,0/ δH 3,33; δC 78,3/ δH 3,42; δC 78,7/ δH 3,37; δC 95,7/ δH
5,40) (d, J = 8,0 Hz), C'''/H''' (δC 62,4/ δH 3,70 và 3,74; δC 72,3/ δH 3,13; δC 76,0/ δH
3,15; δC 78,2/ δH 3,31; δC 78,2/ δH 3,35; δC 103,5/ δH 4,89) (d, J = 7,5 Hz), C''''/H'''' (δC 62,4/ δH 3,70 và 3,84; δC 71,2/ δH 3,34; δC 75,3/ δH 3,32; δC 78,0/ δH 3,36; δC
78,3/ δH 3,30; δC 105,3/ δH 4,63) (d, J = 7,5 Hz) (Hình 4.29 và 4.31). Đây là các bộ tín hiệu đặc trưng của gốc đường glucopyranose [92].
Tương quan HMBC giữa H-1′ (δH 5,40) và C-28 (δC 178,1) (Hình 4.32) chỉ ra rằng có một gốc đường glucopyranosyl được gắn vào C-28 bởi liên kết ester. So sánh dữ liệu phổ với gốc đường glucopyranosyl gắn vào C-28 của hợp chất AL-04, ta thấy khá phù hợp.
Tương quan HMBC giữa Glc H-1′′′ (δH 4,89) và Gal C-2′′ (δC 76,6), Glc H- 1′′′′ (δH 4,63) và Gal C-3′′ (δC 85,4) (Hình 4.32), tương tác pron – proton giữa Glc H-1′′′ và Gal H-2′′ (δH 3,98), Glc H-1′′′′ và Gal H-3′′ (δH 3,82) trên phổ NOESY (Hình 4.36) xác nhận hai phân tử đường glucose gắn vào C-2′′ và C-3′′ của đường galactose.
Proton H-3 được xác định là dạng axial dựa vào hằng số ghép J lớn của H-3 (JH-2/H-3 = 13,5 Hz), điều này phù hợp với sinh tổng hợp khung oleanane [34].
Tương tác giữa H-3 (δH 3,67) với H-23 (δH 3,28/3,78) và H-5 (δH 1,23) (Hình 4.35 và 4.36) trong phổ NOESY nhận định H-3, H-5 và nhóm hydroxymethylene (C-23) có định hướng α. Ngoài ra, các liên kết glycoside được xác định ở dạng β bởi giá trị hằng số ghép của các anomeric proton lớn (J = 7,5 - 8,0 Hz).
Thủy phân AR-04 bằng acid, phân tách các đường bằng sắc ký bản mỏng điều chế. Độ quay cực của đường glucose và glactose được xác định lần lượt là + 19,1 ( 25D, c 0,1, H2O) và + 46,2 ( 25D, c 0,08, H2O). So sánh độ quay cực của đường chuẩn D-glucose và D-galactose là + 18,0 ( 25D, c 0,1, H2O) và + 45,0 ( 25D, c 0,08, H2O), có thể xác định đường thu được là D-galactose và D-glucose.
Từ những dữ kiện phổ trên, hợp chất AR-04 được đề xuất tên gọi là 23- hydroxyoleanolic acid-[28-O-β-D-glucopyranosyl]-3-O-[2''-O-β-D-glucopyranosyl- (3''-O-β-D-glucopyranosyl)]-β-D-galactopyranoside (hay 23-hydroxyoleanolic acid- [28-O-β-D-glucopyranosyl]-3-O-{β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-
glucopyranosyl-(1→3)]-β-D-galactopyranoside}) (Hình 4.37). Tra cứu trên cơ sở dữ liệu Scifinder, cho phép xác định đây là hợp chất mới và được đặt tên là aramatoside C.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
6 CH3
Anomeric proton
H-4''
(J = 3.0 Hz)
Hình 4.27. Phổ 1H NMR của hợp chất AR-04.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
‒C=C<
>C=O
‒O‒C<
Hình 4.28. Phổ 13C NMR của hợp chất AR-04.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
H -1 ''' '
C-1''''
H -1 '''
C-1'''
H -1 ''
C-1''
H -1 '
C-1'
H -3 ''
C-3''
H -3
C-3
H -1 2
C-12
Hình 4.29. Phổ HSQC giãn (80-126 ppm, 3,5-5,5 ppm) của hợp chất AR-04.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
H -2 7 H -2 5 H -3 0 H -2 9 H -2 6 H -2 4
C-29 C-27 C-30
C-26 C-25 C-24
Hình 4.30. Phổ HSQC giãn (10-50 ppm, 0,7-2,3 ppm) của hợp chất AR-04.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
Hình 4.31. Phổ HSQC giãn (61-80 ppm, 3,0-4,2 ppm) của hợp chất AR-04.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
C-1'' C-23
C-3
H -2 4
H -1 '' H -3
H -1 ''' '
C-3'' C-2'' C-18
C-28
H -1 ' H -1 ''' H -1 2
Hình 4.32. Phổ HMBC của hợp chất AR-04.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
C-4 C-5
H -2 4
Hình 4.33. Phổ HMBC giãn của hợp chất AR-04.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
H-2''
H-1''
H-2''/H-3'' H-3''/H-4''
H-5''/H-6''
H-4''/H-5''
Hình 4.34. Phổ COSY của hợp chất AR-04.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 ppm 0.6
ppm
0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2
H-5
H-23
Hình 4.35. Phổ NOESY giãn (2,5-5,5 ppm, 0,5-2,2 ppm) của hợp chất AR-04.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 ppm 3.0
ppm
3.4
3.8
4.2
4.6
5.0
5.4
H-2'' H-3''
H-1'''' H-1''' H-23 H-3
Hình 4.36. Phổ NOESY giãn (2,8-5,5 ppm, 2,8-5,5 ppm) của hợp chất AR-04.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
Hình 4.37. Cấu trúc hóa học (A) và tương tác HMBC và COSY chính (B) của hợp chất AR-04.
Bảng 4.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất AR-04.
C a,bδC a,cδH (J, Hz) C a,bδC a,cδH (J, Hz) 1 39,6 0,99 (*), 1,65 (*) 30 24,0 0,95 (s) 2 26,5 1,80 (*), 1,98 (*) 28-O-Glc
3 84,9 3,67 (dd, 13,5; 5,4) 1' 95,7 5,40 (d, 8,0)
4 44,2 - 2' 74,0 3,33 (dd, 8,0; 9,0)
5 48,0 1,23 (d, 11,0) 3' 78,3 3,42 (t, 9,0; 9,0) 6 18,9 1,38 (m), 1,50 (m) 4' 71,2 3,35 (t, 9,0; 9,0) 7 33,4 1,33 (*), 1,50 (m) 5' 78,7 3,37 (m)
8 40,7 - 6' 62,5 3,70 (m)/3,84 (m)
9 49,1 1,65 (m) 3-O-Gal
10 37,7 - 1'' 104,8 4,53 (d, 7,5)
11 24,6 1,92 (m), 1,94 (m) 2'' 76,6 3,98 (t, 9,0; 7,5) 12 123,8 5,27 (t, 3; 5) 3'' 85,4 3,82 (t, 9,0; 3,0)
13 144,9 - 4'' 70,0 4,14 (br d, 3,0)
14 43,0 - 5'' 76,0 3,56 (m)
15 28,9 1,12 (m), 1,81 (m) 6'' 63,5 3,57 (m)/3,83 (m) 16 24,0 1,72 (m), 2,08 (m) 2''-O-Glc
17 48,5 - 1''' 103,5 4,89 (d, 7,5)
18 42,6 2,87 (dd, 13,5; 3,5) 2''' 76,0 3,15 (dd, 9,0; 7,5) 19 47,2 1,17 (m), 1,74 (m) 3''' 78,2 3,31 (t, 9,0; 9,0)
20 31,5 - 4''' 72,3 3,13 (t, 9,0; 9,0)
21 34,9 1,23 (*), 1,40 (*) 5''' 78,2 3,35 (m)
22 33,2 1,62 (*), 1,76 (m) 6''' 62,4 3,70 (m)/3,74 (m) 23 64,8 3,78 (d, 12,0)
3,28 (d, 12,0)
3''-O-Glc
24 13,2 0,76 (s) 1'''' 105,3 4,63 (d, 7,5) 25 16,4 1,00 (s) 2'''' 75,3 3,32 (dd, 9,0; 7,5) 26 17,8 0,83 (s) 3'''' 78,3 3,30 (t, 9,0; 9,0) 27 26,4 1,19 (s) 4'''' 71,2 3,34 (t, 9,0; 9,0)
28 178,1 - 5'''' 78,0 3,36 (m)
29 33,5 0,93 (s) 6'''' 62,4 3,70 (m)/3,84 (m)
(*): Tín hiệu lồng chập. Đo trong a)CD3OD, b)125 MHz, c)500 MHz. Tín hiệu được xác định trên phổ HSQC và HMBC, COSY và NOESY. Glc: β-D-glucopyranosyl, Gal: β-D-galactopyranoside.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế