4.2.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất tinh khiết được phân lập từ lá A. armata
Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất tinh khiết từ lá A. armata trải qua hai giai đoạn: thử nghiệm sàng lọc và thử nghiệm chính thức.
Trong giai đoạn thử nghiệm sàng lọc, các hợp chất được kiểm tra ảnh hưởng của chỳng đối với khả năng tồn tại của tế bào HT29. Tại nồng độ 30 àM, cỏc hợp chất AL-01 ‒ AL-06, AL-09, AL-12 không thể hiện hoạt tính gây độc tế bào, điều này được thể hiện bởi khả năng tồn tại của tế bào HT29 khá cao (> 89 %) sau thử
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
nghiệm. Trong khi đó, các hợp chất AL-07, AL-08, AL-10, AL-11 có tiềm năng chống tế bào ung thư tốt, thể hiện qua khả năng sống sót của tế bào HT29 thấp, dao động từ 4,21 ± 0,06 % đến 7,56 ± 0,11 % (Bảng 4.22).
Bảng 4.22. Ảnh hưởng của cỏc hợp chất tinh khiết từ lỏ A. armata (30 àM) đối với khả năng sống sót của tế bào HT29.
Hợp chất Khả năng sống sót (%)
AL-01 98,60 ± 1,51
AL-02 97,20 ± 1,44
AL-03 89,12 ± 0,20
AL-04 91,35 ± 0,41
AL-05 95,68 ± 1,22
AL-06 98,41 ± 1,57
AL-07 7,56 ± 0,11
AL-08 4,21 ± 0,06
AL-09 93,34 ± 1,39
AL-10 5,16 ± 0,08
AL-11 6,36 ± 0,09
AL-12 97,51 ± 1,45
Đối chứng dương (Irinotecan hydrochloride)
33,53 ± 0,35
Dựa trên kết quả thử nghiệm sơ bộ, các hợp chất AL-07, AL-08, AL-10, AL-11 được đưa vào thử nghiệm chớnh thức để tỡm giỏ trị IC50 (àM) đối với cỏc dòng tế bào HT29, A2058, A549.
Theo tiêu chuẩn của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ, chất tinh khiết được coi là cú hoạt tớnh tốt khi IC50 ≤ 5 àM [39]. Kết quả thử nghiệm đối với cỏc hợp chất AL-07, AL-08, AL-10, AL-11 cho giỏ trị IC50 dao động từ 2,01 ± 0,17 àM đến 18,8 ± 1,17 àM (Bảng 4.23), chứng tỏ cỏc hợp chất thể hiện hoạt tớnh gõy độc tế bào ung thư khá tốt.
Các hợp chất thể hiện khả năng ức chế tế bào ung thư nổi bật hơn ở các dòng tế bào HT29 và A549 so với dòng tế bào A2058. Đáng chú ý, hợp chất AL-07 và AL-08 thể hiện khả năng gây độc tế bào ung thư một cách mạnh mẽ trên các dòng HT29 và A549. Cụ thể, giá trị IC50 của hợp chất AL-07 và AL-08 lần lượt gấp 1,5 - 1,6 lần và 4,9 - 5,1 lần so với đối chứng dương (Irinotecan hydrochloride) ở dòng HT29 và A549. Ngoài ra, các hợp chất AL-10 và AL-11 với giá trị IC50 nằm trong khoảng 11,9 ± 3,79 àM đến 13,9 ± 1,16 àM, gần bằng với giỏ trị IC50 của đối chứng dương, cũng cho thấy hai hợp chất này có tác dụng ức chế các dòng tế bào ung thư HT29 và A549 khá tốt.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
Đối với dòng tế bào ung thư A2058, các hợp chất AL-08 và AL-11 với giá trị IC50 khoảng 4,26 ± 0,50 àM đến 4,61 ± 1,24 àM được đỏnh giỏ cú hoạt tớnh gõy độc tốt, hai hợp chất còn lại là AL-07 và AL-10 có giá trị IC50 nằm trong khoảng 9,41 ± 1,72 àM đến 18,8 ± 1,17 àM được đỏnh giỏ là cú hoạt tớnh tương đối tốt.
Bảng 4.23. Hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất tinh khiết từ lá A. armata.
TT Hợp chất IC50 (àM)
HT29 A2058 A549 HEK-293A 1 AL-07 6,51 ± 1,64 9,41 ± 1,72 6,51 ± 1,6 >100 2 AL-08 2,02 ± 1,65 4,26 ± 0,50 2,01 ± 0,17 55,04 ± 2,32 3 AL-10 13,9 ± 1,16 18,8 ± 1,17 12,5 ± 0,9 >100 4 AL-11 11,9 ± 3,79 4,61 ± 1,24 12,0 ± 2,79 >100 5 Đối chứng
dương
10,3 ± 1,32 (*)
1,27 ± 0,56 (*)
9,89 ± 0,19 (*)
1,83 ± 0,12 (#)
(*): Irinotecan hydrochloride, (#): Ellipticine.
Ngoài ra, để đánh giá độ an toàn của các hoạt chất có khả năng gây độc tế bào ung thư, độc tính đối với dòng tế bào thường (tế bào thận gốc phôi HEK-293A) cũng được thử nghiệm. Các số liệu thu được sau thử nghiệm chỉ ra rằng, các hợp chất AL-07, AL-10, AL-11 không gây độc đối với tế bào thường. Điều đáng nói, hợp chất AL-08 với hoạt tính gây độc tế bào ung thư mạnh mẽ có thể gây độc cả với tế bào thường (IC50 55,04 ± 2,32 àg/mL); tuy nhiờn, hợp chất AL-08 vẫn được đánh giá là an toàn bởi nồng độ ức chế 50 % đối với tế bào thường lớn hơn nhiều so với tế bào ung thư cũng như đối chứng dương (ellipticine) (Bảng 4.23).
Theo tra cứu tài liệu tại thời điểm nghiên cứu, các hợp chất oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (AL-07), narcissiflorine (AL-08), stipuleanoside R1 (AL-10) chưa từng được thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư. Năm 2019, Yan và cộng sự đã công bố hợp chất AL-07 có tác dụng ức chế sản sinh NO do lipopolysaccharide gõy ra với giỏ trị IC50 là 11,28 ± 1,03 àM [125]. Hợp chất chikusetsusaponin IVa (AL-11) được phân lập từ rễ loài Panax stipuleanatus thể hiện hoạt tớnh gõy độc tế bào trung bỡnh đối với giỏ trị IC50 là 76,28 àM và 78,11 àM lần lượt đối với cỏc dũng tế bào HL-60 và HCT-116 [76]. Hợp chất AL-11 cũng đã được chứng minh có khả năng ức chế dòng tế bào ung thư biểu mô ở gan (SK-Hep-1) với giỏ trị IC50 là 18,9 àg/mL [132]. Hợp chất này được cụng bố cú khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư tuyến tiền liệt phụ thuộc vào liều lượng và thời gian, thử nghiệm được đánh giá với nồng độ >12,5 mmol/L; đồng thời không gây độc đối với tế bào thường của tuyến tiền liệt tại nồng độ 100 mmol/L trong vòng 48 giờ [147]. Như vậy, kết quả thử nghiệm độc tế bào đối với hợp chất AL-11 phù hợp với các công bố trước đây. Ngoài ra, hợp chất chikusetsusaponin IVa còn có tác dụng ức chế quá trình đông máu (IC50 199,4 ± 9,1 μM) [19]; ức chế α-
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
glucosidase chống bệnh tiểu đường (IC50 3,23 μg/mL) [71]; kháng virus HVS-1, HVS-2, virus Cytomegalo ở người, virus sởi, virus quai bị (MUMPS) với chỉ số chọn lọc CC50/IC50 lần lượt là 29; 30; 73; 25 và 25 μg/mL [95].
Ngoài ra, hợp chất chikusetsusaponin IVa methyl ester (AL-03/AR-13) có khả năng ức chế Wnt/β-catenin, hỗ trợ điều trị ung thư trực tràng [63]. Các hợp chất stipuleanoside R1 (AL-10/AR-03), chikusetsusaponin IV (AL-06/AR-01), oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (AL-07) có tác dụng ức chế đối với sự gia tăng nồng độ glucose huyết tương [35, 134]; hợp chất stipuleanoside R1 còn có hoạt tính kháng viêm [105], chống đông máu [119]. Hợp chất chikusetsusaponin IVa (AL-11/AR-11) có tác dụng chống virus sởi, virus quai bị [95], chống hình thành máu đông [19], giúp tăng sinh tế bào lách [96], chống béo phì [128]. Các hợp chất còn lại được phân lập trong Luận án này chưa được công bố hoạt tính sinh học.
4.2.2. Độc tính cấp trên chuột của phân đoạn nước thuộc lá cây A. armata Để kiểm chứng độ an toàn của các hoạt chất thuộc lá cây A. armata, độc tính cấp của phân đoạn nước từ lá A. armata được thử nghiệm trên chuột nhắt trắng (Hình 4.58). Trong 24 giờ đầu tiên của cuộc thử nghiệm, chuột ăn uống và sinh hoạt bình thường sau khi uống thuốc, riêng nhóm 6 có biểu hiện giảm hoạt động nhẹ. Sau 72 giờ theo dõi, các nhóm 1 - 2 vẫn sinh hoạt bình thường; nhóm 3 có biểu hiện kém ăn và giảm hoạt động, 01 cá thể tử vong; nhóm 4 - 6 có triệu chứng nhiễm độc như tiêu chảy, chậm chạp, chán ăn, 01 - 03 cá thể tử vong ở mỗi nhóm.
Hình 4.58. Hình ảnh thử nghiệm độc tính cấp trên chuột.
Sau 07 ngày thử nghiệm, hiện tượng tử vong xuất hiện ở các nhóm 3 - 6, số cá thể tử vong tăng dần theo liều dùng (Bảng 4.24); trong khi đó, nhóm đối chứng vẫn sinh hoạt bình thường, các nhóm 1 - 2 không có biểu hiện quá khác biệt so với nhóm đối chứng.
Luận văn thạc sĩ Kinh tế
Bảng 4.24. Kết quả thử nghiệm độc tính cấp đối với phân đoạn nước từ lá A. armata.
Nhóm chuột Số chuột thí nghiệm
(con)
Liều dùng (g/kg)
Thể tích cho uống (mL)
Tỷ lệ chết/sống (con/con)
1 10 25 0,6 mL x 03 lần 0/10
2 10 50 0,6 mL x 03 lần 0/10
3 10 100 0,6 mL x 03 lần 3/7
4 10 150 0,6 mL x 03 lần 5/5
5 10 200 0,6 mL x 03 lần 7/3
6 10 250 0,6 mL x 03 lần 8/2
Đối chứng 10 Nước cất 0,6 mL x 03 lần 0/10
Dựa vào số liệu thu nhận sau thử nghiệm, giá trị LD50 được xác định là 149,256 g/kg. Theo phân loại độc tính của Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (Organisation for Economic Cooperation and Development - OECD), những chất có giá trị độc tính cấp LD50 trong khoảng >5 g/kg được coi là chất gần như không độc [2].
Ở đây, liều gây chết trung bình của cao chiết gấp gần 30 lần so với quy định mức gây độc của OECD, chứng tỏ phân đoạn nước của lá A. armata có tính an toàn cao trong thử nghiệm đánh giá độc tính cấp trên chuột. Kết quả này phù hợp với công bố của Zhao (2020) [142]. Độc tính cấp của một loài cây cùng chi với loài A.
armata là Aralia elata đã được thử nghiệm trên dịch chiết ethanol từ lá A. elata, cho giá trị LC50 là 3,16 g/kg đối với chuột cái và 5,84 g/kg đối với chuột đực [69]. Điều này cho thấy phân đoạn nước từ lá A. armata an toàn đối với chuột hơn dịch chiết ethanol từ lá A. elata.