CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU
1.4 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens
Phân loại:
Giới (kingdom): Bacteria
Ngành (Phylum): Firmicutes
Lớp (Class): Bacilli
Bộ (Order): Bacillales
Họ (Family): Bacillaceae
Giống (Genus): Bacillus
Loài : Bacillusamyloliquefaciens
Hình 1.9 Khuẩn lạc B. amyloliquefaciens 1.4.2 Đặc điểm phân bố [6]
Bacillus amyloliquefaciens là trực khuẩn Gram dương, pH acid – trung tính – kiềm.
Được tìm thấy tự nhiên trong đất và rác lá, có thể dễ dàng phát triển với số lượng lớn. Trong bột mì, B. amyloliquefaciens chiếm khoảng 75-95% vi khuẩn tạo bào tử.
Trong các sản phẩm thực phẩm truyền thống như mắm, tương, cơm mẻ (cơm lên men chua)… chúng cũng có mặt và có vai trò đáng kể trong quá trình biến đổi sinh học.
1.4.3 Đặc điểm hình thái [5] [7]
Là trực khuẩn nhỏ, thẳng, có kích thước 0,5-2,5 x 1,2-10μm, thường xếp thành cặp đôi hay chuỗi ngắn, hai đầu tế bào tròn hoặc hơi vuông. Bào tử hình bầu dục có kích thước 0,6 – 0,9μm, không phân bố theo một nguyên tắc chặt chẽ nào - lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm.
Hình 1.10 Hình nhuộm tế bào vi khuẩn B.amyloliquefaciens
Là trực khuẩn Gram dương, hiếu khí, khi còn non di động bằng tiên mao; về già, tiên mao rụng nên mất khả năng di động. Khuẩn lạc khô hoặc nhớt, vô màu hay có màu trắng xám nhạt, hơi nhăn hay tạo thành lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn, mép lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào mặt thạch [5].
1.4.4 Cấu trúc [15] [16]
Các vi khuẩn Gram dương khác, cấu trúc bề mặt của Bacillus khá phức tạp và có các đặc tính kết dính và chống chịu điều kiện khắc nghiệt cao. Bề mặt tế bào được cấu tạo bởi các lớp giáp mạc, lớp bề mặt có tính chất protein (S-layer), một vài lớp lót peptidoglycan và các protein trên mặt ngoài của màng tế bào.
Hình 1.11 Cấu trúc và bề mặt vi khuẩn B.amyloliquefaciens C=Capsule; S=S-layer; P=Peptidoglycan.
S-layers
Hiện diện trong một số thành viên của giống Bacillus. Chức năng chưa được xác định một cách rõ ràng, nhưng dường như có liên quan đến tính kết dính của vi khuẩn.
Giáp mạc (capsules)
Thành phần hóa học của lớp vỏ nhày ở các vi khuẩn khác nhau cũng khác nhau, thường là được tạo nên từ các polysaccharide, nitrogen, phosphorite và có thể có cả polypeptide, nhưng thành phần chủ yếu vẫn là nước (98%), có nhiệm vụ như một hàng rào thẩm thấu để bảo vệ tế bào chống lại quá trình khô.
Vách tế bào
Vách tế bào rất mỏng (100-200Å) và trong suốt không màu. Vách tế bào có tính chất đàn hồi và có độ bền rất lớn, có thể chịu được áp suất cao. Thành phần hóa học chủ yếu là glucid, một số chất béo, protide và các acid amin. Thành phần hóa học thay đổi tùy loại vi khuẩn và môi trường sống.
1.4.5 Sự hình thành bào tử [6]
Sự hình thành bào tử: một số vi khuẩn vào cuối thời kỳ sinh trưởng phát triển sẽ sinh ra bên trong tế bào một thể nghỉ có dạng hình cầu hay hình bầu dục được gọi là bào tử hay nội bào tử. Bào tử có tính kháng nhiệt, kháng bức xạ, kháng hoá chất, kháng áp suất thẩm thấu. Trong thời kỳ nghỉ, không thấy bào tử vi khuẩn thể hiện bất kỳ một hoạt lực trao đổi chất nào cả. Người ta gọi đó là trạng thái sống ẩn. Bào tử có thể giữ sức sống từ vài năm đến vài chục năm. Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống 200-300 năm của bào tử vi khuẩn B.amyloliquefaciens. Một trong những đặc điểm quan trọng của B.amyloliquefaciens là khả năng tạo bào tử trong những điều kiện nhất định.
Các tế bào sinh bào tử khi gặp điều kiện cạn kiệt thức ăn hoặc có tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại sẽ bắt đầu thực hiện quá trình hình thành bào tử. Về mặt hình thái, có thể chia quá trình hình thành bào tử ra thành các giai đoạn:
Hình thành những búi chất nhiễm sắc
Tế bào bắt đầu phân cắt không đối xứng, tạo ra một vùng nhỏ gọi là tiền bào tử.
Tiền bào tử hình thành hai lớp màng, tăng cao tính kháng bức xạ.
Lớp vỏ sơ khai hình thành giữa hai lớp màng của bào tử sau khi đã tích lũy nhiều PG và tổng hợp DPA, tích lũy canxi. Tính chiết quang tăng cao.
Kết thúc việc hình thành áo bào tử.
Kết thúc việc hình thành vỏ bào tử, bắt đầu có tính kháng nhiệt.
Bào nang vỡ ra, bào tử thoát ra ngoài
1.4.6 Hệ enzyme protease của B. amyloliquefaciens [13][11]
B. amyloliquefaciens được nuôi trên môi trường lỏng để kích thích việc sinh tổng hợp enzyme protease (trung tính và kiềm). Điều kiện tối ưu cho việc sinh tổng enzyme protease là : nồng độ cơ chất: 0,5%, thời gian ủ: 30 giờ, nhiệt độ ủ: 40oC, pH: 7, dung dịch đệm: đệm phosphate, môi trường dinh dưỡng: nước chiết thịt bò có bổ sung muối, nguồn C: lactose, nguồn N: (NH4)2SO4, nguồn acid amin: valine. Môi trường dinh dưỡng này rất khắc nghiệt với vi khuẩn B.A vì thế muốn tồn tại và phát triển bắt buộc vi khuẩn B.A phải tiết ra enzyme protease để thuỷ phân protein thành các acid amin cung cấp cho sự phát triển của chúng.
Các acid hữu cơ như acid acetic, acid lactic, acid citric ở các nồng độ khác nhau có thể làm giảm khả năng sinh tổng hợp protease. Enzyme protease được tinh sạch bằng muối (NH4)2SO4 và màng lọc sephadex G200. [4] [11]
Điều kiện để hoạt tính enzyme protease đạt cực đại là: pH 7, dung dịch đệm: đệm phosphate, thời gian ủ: 24 giờ, nhiệt độ ủ: 35oC, B. amyloliquefaciens tổng hợp protease ngoại bào (exoprotease) phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có trong môi trường dinh dưỡng thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật dễ dàng hấp thụ.
1.4.7 Công dụng của B.amyloliquefaciens [24] [11]
- Không có tác dụng gây hại cho sức khỏe con người theo nghiên cứu của viện sinh học nhiệt đới thì vi khuẩn B.A và B.subtilis là lợi khuẩn chúng có khả năng tiết ra enzyme amylase và protease thuỷ phân tinh bột, protein không tan, ngoài ra chúng không sản sinh ra chất độc nguy hiểm cho con người. [11] [17]
- Tạo kháng sinh: eumycin, bacillin, bacillomin chống được nhiều loại vi trùng gây bệnh.
- Các enzyme thủy phân protein được tìm thấy ở khắp nơi, trong tất cả các sinh vật sống, quan trọng cho sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào. Mặc dù có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp protease nhưng chỉ có vài loài sinh tổng hợp được enzyme protease có giá trị thương mại, trong đó B.amyloliquefaciens có vai trò nổi bật trong các ngành công nghiệp khác nhau như thực phẩm, sữa, dược, dệt. Protease là một trong những nhóm enzyme công nghiệp quan trọng nhất, chiếm gần 60% tổng lượng enzyme được bán ra, được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp tẩy rửa khô, sản xuất các loại thuốc tiêu hóa, thuốc điều trị các vết thương do bỏng hay do tác nhân virus.
CHƯƠNG 2