CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3 Sơ đồ nghiên cứu vi sinh vật
2.3.1 Nghiên cứu hình thái và đặc điểm sinh lý của vi khuẩn B.
amyloliquefaciens
Nghiên cứu vi khuẩn B.A bao gồm: hình thái, sinh lý và định tính hoạt tính enzyme protease
2.3.1.1 Quan sát hình thái của vi khuẩn B.A bằng phương pháp nhuộm Gram [ 12,13]
Nguyên tắc :
Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào với thuốc tím kết tinh (crystal violet) và iod mà vi khuẩn chia làm 2 nhóm khác nhau là:
Nhóm thứ nhất vẫn giữ nguyên màu tím của thuốc nhuộm, không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn do có lớp vỏ tế bào dày tạo bởi peptidoglycan. Cồn làm cho các lỗ trong peptidoglycan co lại do đó phức chất tím tinh thể iod bị giữ lại trong tế bào. Vi sinh vật thuộc nhóm này là Gram dương.
Nhóm thứ hai có lớp vỏ tế bào mỏng hơn (do có ít peptidoglycan hơn) nhưng lượng lipid của lớp màng ngoài cao hơn; khi bị tẩy bằng cồn, lipid bị hòa tan nhiều hơn và vi khuẩn mất màu. Khi nhuộm bổ sung, chúng sẽ bắt màu thuốc nhuộm mới (đỏ vàng, đỏ tía, hồng). Vi sinh vật nhóm này là Gram âm.
2.3.1.2 Quan sát bào tử của B.A bằng phương pháp nhuộm bào tử [ 12]
Nguyên tắc :
Do sự khác nhau về sinh lý, sinh hoá của bào tử và tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn B.A nên với thuốc nhuộm Fuchsin, HCl 0,5%, H2SO4 1% và xanh methylen thì bào tử của vi khuẩn B.A sẽ mang màu đỏ, tế bào sinh dưỡng sẽ mang màu xanh.
2.3.1.3 Định tính enzyme protease của vi khuẩn B.amyloliquefaciens [8]
Nguyên tắc:
Vi sinh vật tiết enzyme protease phân giải casein thành polypeptide và acid amin Cách tiến hành: Tăng sinh vi khuẩn B.amyloliquefaciens trên môi trường sữa đậu nành trong 24 giờ. Đục một lỗ trên môi trường NB (Nutrient broth) thạch đĩa có bổ sung 1% casein. Nhỏ dịch tăng sinh B.amyloliquefaciens vào, ủ ở 37oC trong 24 giờ.
Đọc kết quả:
Nhỏ thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần lên bề mặt thạch. Kiểm tra vòng phân giải casein.
Phản ứng (+): môi trường xung quanh vi khuẩn xuất hiện màu xanh Phản ứng (-): môi trường không bắt màu với thuốc thử folin
2.3.1.4 Đặc điểm sinh lý của vi khuẩn B.A bằng cách khảo sát ảnh hưởng pH đến sự tăng sinh B.A.
Nguyên tắc:
pH là thước đo nồng độ ion hydro trong dung dịch. Dung dịch với nồng độ ion hydro tăng mang tính acid, ngược lại khi nồng độ ion hydro giảm thì mang tính kiềm. Hầu hết các vi khuẩn thuộc loại trung tính, biên độ pH khoảng 6,5 -7,5.
Ta có thể thấy khả năng thích nghi của vi sinh vật khi nhìn vào môi trường sống của chúng. Ví dụ, vi sinh vật ở da có thể chịu được khoảng pH 5 và các vi sinh vật ở dạ dày-ruột có thể chịu được khoảng pH 3. Các vi sinh vật có thể chịu được khoảng pH thấp nhưng không tăng trưởng được thuộc nhóm không ưa acid. Các vi sinh vật có thể chịu được và tăng trưởng được ở pH thấp thuộc nhóm ưa acid. Nhóm vi sinh vật ưa acid quan trọng là nấm (nấm có biên độ pH tối ưu là 4-6).
Một tế bào có thể phân chia theo cấp số nhân cho đến khi hình thành một khuẩn lạc có thể trông thấy được. Đây là cơ sở của việc định lượng tế bào trên thạch đĩa, bởi vì số lượng khuẩn lạc sinh ra từ một thể tích giống vi sinh vật nhất định chỉ số lượng tế bào sống có trong thể tích giống đó. Thông thường, tất cả các tế bào ở phase tăng trưởng hay giai đoạn sớm của phase ổn định đều có khả năng hình thành khuẩn lạc.
Vì vậy, số lượng khuẩn lạc đếm được gần như tương đương với số lượng tế bào sống.
Để định lượng chính xác, cần phải thực hiện sao cho mỗi một khuẩn lạc chỉ được hình thành từ một tế bào. Do dịch tế bào sử dụng trong các phòng thí nghiệm có nồng độ cao, thường nhiều hơn 10^6 tế bào/ml, nên cần thiết phải được pha loãng
trước khi cấy. Phương pháp chuẩn là thực hiện các bước pha loãng để giảm nồng độ tế bào từ 10 đến 100 lần cho đến khi đạt vài nghìn tế bào/ml.
Cách thực hiện:
Cấy tăng sinh: Lấy một vòng que cấy vi khuẩn từ thạch nghiêng CP cấy vào một bình NB (20ml) (nhân giống cấp 1), lắc ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ.
Từ bình tăng sinh, dùng pippette vô trùng hút một thể tích canh khuẩn đem pha loãng, Sau đó cấy dịch pha loãng này sang các bình môi trường NB khác đã được chỉnh pH thích hợp, pH 7 (tỉ lệ 1%)
Khảo sát sinh khối sau 0 giờ, 8 giờ, 16 giờ, 24 giờ, 32 giờ, 40 giờ và 48 giờ.
Sau mỗi thời gian quy định như trên, hút từ mỗi bình 5ml. Pha loãng dịch huyền phù tế bào ở các nồng độ thích hợp 10^-1, 10^-2, 10^-3 ... và thực hiện thao tác đếm vi khuẩn trên buồng đếm hồng cầu.
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.3.2 Phương pháp nghiên cứu hình thái, hoạt chất sinh học, đặc điểm sinh hoá của nấm sợi Linh chi
2.3.2.1. Phương pháp làm tiêu bản để quan sát hình thái nấm sợi Linh chi [4]
- Đặt vào đáy hộp petri một tờ giấy thấm, đặt tiếp lên đó một miếng lame. Đậy lại, gói giấy và đem khử trùng.
- Đun chảy môi trường dinh dưỡng PGA đã khử trùng trong ống nghiệm.
- Mở hé nắp đĩa petri gần ngọn lửa đèn cồn, đổ thạch trong ống nghiệm lên miếng lame sao cho thạch chảy dài thành một lớp mỏng một bên của tấm lame.
- Khi thạch trên lame đã đặc lại, nhỏ nước cất vô trùng thấm đều tờ giấy thấm mà không tràn lên lame.
- Dùng que cấy móc, khều nhẹ vào khuẩn lạc nấm sợi rồi chấm lên phần thạch của miếng lame trong phòng ẩm.
- Hộp được gói giấy và nuôi ủ ở nhiệt độ phòng 2-3 ngày.
- Mở hộp petri và lấy lame bên trong ra.
- Dùng giấy thấm chùi mặt đáy của lame.
- Đậy lamelle lên chỗ có khuẩn lạc mọc và đặt dưới kính hiển vi để quan sát mẫu.
2.3.2.2. Phương pháp xác định các hoạt chất sinh học của nấm sợi Linh chi [29]
Định tính saponin bằng phản ứng Liebermann-Burchard
Nguyên tắc: Trong điều kiện có H2SO4 đậm đặc thì saponin sẽ tan trong H2SO4 đậm đặc và khi cho anhydrid acetic và CHCl3 thì saponin sẽ tạo bọt sau một thời gian bọt sẽ tan lúc đó có sự hình thành một lớp ngăn cách có màu nâu đỏ, kết luận có saponin.
Cách tiến hành
Cho vào ống nghiệm khoảng 0,5g dược liệu, thêm 5ml cồn 70o và đun cách thủy trong 5 phút. Lọc qua bông vào một chén sứ, cô trên bếp cách thủy đến cặn thật khô.
Cho vào cặn này 1ml anhydrid acetic và 1 ml CHCl3, khuấy kỹ cho tan, lọc bằng pipet Pasteur bịt bông, cho vào một ống nghiệm thật khô. Để ống nghiệm trên giá, nghiêng giá và dùng pipet cho thật nhẹ nhàng khoảng 0,5ml H2SO4 đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm. Mặt ngăn cách giữa 2 lớp sẽ có màu từ nâu tới đỏ, đỏ-tím hay tím. Quan sát đồng thời lớp dung dịch phía trên có thể có màu xanh lá, xanh rêu, vàng-nâu, nâu-đỏ…
Định tính alkaloid
Nguyên tắc: Trong môi trường có dung dịch HgCl2 và dung dịch KI thì các alkaloid sẽ kết tủa màu trắng, màu kết tủa của alkaloid phụ thuộc vào từng loại thuốc thử khác nhau như đối với thuốc thử thuốc thử Wagner: hòa tan 5g I2 trong 100ml dung dịch KI 10%. Các alkaloid cho tủa màu nâu sáng đến nâu đen (phần lớn ở dạng tủa bông hoặc bọt, đôi khi tạo thành giọt dầu có màu nâu đen).
Cách tiến hành:
Chuẩn bị mẫu: ngâm bột nguyên liệu trong dung dịch H2SO4 loãng 1%, sau đó cho lên nồi đun cách thủy 15 phút. Lọc nước chiết. Từ đây có thể định tính được alkaloid, tiến hành cho các thuốc thử vào và quan sát kết tủa.
Định tính steroid bằng phản ứng Salkowki:
Nguyên tắc: các steroid sẽ tan trong H2SO4 đậm đặc và với sự có mặt của CHCl3 sẽ tấn công vào nhóm chức của steroid tạo phản ứng màu đỏ sẫm.
Cách tiến hành
Hòa tan 1-2mg mẫu trong CHCl3 và nhỏ vào 1ml H2SO4 đậm đặc. để yên trong 15p và quan sát màu của phản ứng.
2.3.2.3 Phương pháp định tính enzyme cellulase của nấm sợi Linh chi bằng cách đo đường kính vòng phân giải [4]
Nguyên tắc:
Trong môi trường thạch có bổ sung cơ chất cảm ứng CMC ( carboxyl methyl cellulose ), nấm sợi Linh chi sẽ tiết ra enzyme cellulase để thuỷ phân cơ chất CMC thành đường glucose. Glucose không cho phản ứng màu với thuốc thử lugol và hình thành vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc. Vì vậy, có thể định tính hoạt tính của enzyme cellulase của Linh chi dựa vào đường kính vòng phân giải cơ chất sau khi nhuộm với thuốc thử lugol. Đường kính vòng phân giải tương ứng với hoạt tính của enzyme.