- Thu mẫu: mẫu cá mặt quỷ dùng cho nghiên cứu, được thu mua ngẫu nhiên với các kích thước khác nhau từ ngư dân đánh bắt ngoài biển (Đảo Phú Quý) và đại lý thu mua Hải sản tươi sống Hải Lành, thành phố Phan Thiết, tỉnh Bình Thuận.
Định kỳ mỗi tháng thu tối thiểu 10 con cá mặt quỷ còn sống và vận chuyển về Viện Nghiên cứu NTTS III nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh sản.
- Phương pháp thu thập số liệu:
Các thông số đo, đếm được xác định theo phương pháp của Pravdin (1973): + TL (total lengh): Chiều dài toàn thân tính từ mõm cá đến tia vây đuôi cuối cùng dài nhất.
+ Chiều dài tuyến sinh dục (được đo bằng thước có độ chính xác đến 1mm). + Khối lượng cá ban đầu.
+ Khối lượng cá không nội tạng.
+ Khối lượng tuyến sinh dục (cân điện tử có độ chính xác đến 0,1g). + D (Doral fin): vây lưng.
+ A (Anal fin): vây hậu môn. + C (Cadal fin): vây đuôi. + P (Pectoral fin): vây ngực. + V (Ventral fin): vây bụng.
Xử lý mẫu tuyến sinh dục:
Tiến hành giải phẫu cá để thu tuyến sinh dục. Cá được mổ bụng theo đường vòng cung kéo dài từ hậu môn lên đến vây ngực. Sau đó, lấy tuyến sinh dục loại bỏ phần mở bám vào tuyến sinh dục, rửa sạch máu. Tuyến sinh dục được cố định bằng dung dịch Bouin và gửi đi phân tích tiêu bản tổ chức học tại Trường Đại học Nha Trang. Các bước tiến hành như sau:
Bước 1: định hình, vùi và cắt mẫu
- Định hình: Cắt mẫu có kích thước tối đa 1cm3, cho vào dung dịch Bouin với thể tích lớn gấp 30 – 50 lần thể tích mẫu. Chất định hình Bouin có công thức sau:
+ 750ml dung dịch acid picric bão hòa + 250ml formalin 40%
+ 50ml acid axetic đậm đặc
Định hình mẫu trong 24 – 72 giờ, sau đó đem rửa nước. Nếu chưa có thời gian để làm các bước tiếp theo sau khi cố định thì cho mẫu từ dung dịch Bouin vào dung dịch Formol 10% (gọi là dung dịch đợi) để bảo quản lâu dài, tránh hiện tượng cố định quá mức.
- Rửa mẫu:
Mẫu được rửa dưới vòi nước chảy trong khoảng 6 giờ hoặc ngâm trong cốc nước to và cứ 15 – 20 phút thay nước một lần trong 8 – 10 giờ tùy thuộc vào kích thước mẫu.
- Khử nước ở mẫu cố định: Sau khi rửa nước, mẫu được chuyển qua dung dịch cồn có nồng độ khác nhau tăng dần, từ cồn 700 rồi sang 900 – 960 – 10001 – 10002 mỗi lần 1 – 2 giờ tùy kích thước mẫu.
- Làm trong mẫu: lần lượt chuyển mẫu đã khử nước vào: + Cồn - Xilen (tỷ lệ 1:1): 1 lần trong 60 phút
+ Xilen II: 1 lần trong 60 phút + Xilen I: 1 lần trong 60 phút
- Thấm parafin: chuyển mẫu lần lượt vào:
+ Xilen – parafin (tỷ lệ 1:1) để ở nhiệt độ 37 – 400C + Parafin2, parafin1 ở nhiệt độ từ 56 – 580C
Mỗi bước tiến hành trong 4 – 6 giờ
Sau đó ngâm trong parafin nguyên chất có trộn thêm 5 – 10% sáp ong, để ở 58 – 600C trong 12 giờ rồi đem ra đúc (không được để nhiệt độ tăng quá 600C vì sẽ làm mẫu quá cứng và dễ vỡ).
- Đúc parafin:
+ Lấy parafin của lần thấm cuối cùng để đúc
+ Chuẩn bị khuôn đúc bằng giấy sáp hoặc đĩa đồng hồ có bôi 1 lớp glyxerin rất mỏng (lớp glyxerin này làm parafin sau khi nguội sẽ tự bong ra khỏi đĩa).
+ Parafin đã nóng chảy (có thể đun hẹ để nhiệt độ khoảng 650C) được đổ vào khuôn đúc, chờ khi parafin hơi đục lại và dưới đáy có 1 lớp đã đông thì dùng panh nhỏ hơ nóng gấp mẫu đưa vào khuôn và chỉnh mẫu sao cho chiều cắt là thẳng đứng (phải hơ nóng panh để tránh sự đông đặc nhanh và tạo bọt khí của parafin khi gặp lạnh, khi cắt mẫu dễ bị đứt).
+ Sau khi khối parafin đã đông đặc lại nhưng vẫn còn hơi nóng thì thả vào cốc nước lạnh để parafin được biệt hóa đồng đều, tạo độ dẻo và kết dính tốt.
+ Mẫu sau khi đúc để 24 giờ cho parafin ổn định thì mới cắt.
- Cắt lát mỏng: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Khối parafin đã đúc được cắt thành miếng mỏng hình thang cân sao cho mẫu nằm chính giữa khối và lớp parafin bao phủ đủ dày để mẫu không bị vỡ khi cắt.
+ Dùng dao mỏng hơ nóng và gắn khối parafin có mẫu lên đế cắt của máy Microtom, sửa lại khối cho đúng hình thang cân, các cạnh phải song song với nhau để khi cắt các lát mỏng sẽ nối với nhau thành băng thẳng, giúp cho việc gắn lên lam kính dễ dàng và đẹp hơn.
+ Chỉnh độ nghiêng của lưỡi dao khoảng 450, kẹp đế có mẫu vào và cạnh của khối song song với lưỡi dao, chỉnh để khối parafin gần sát với lưởi dao, điều chỉnh độ dài lát cắt cho thích hợp (khoảng 7 - 12µm).
+ Quay tay theo chiều kim đồng hồ để cắt mẫu thành những lát cắt mỏng, dùng bút lông hoặc kim nhỏ để đỡ lát cắt, chuyển các lát cắt vào hộp đĩa petri có lót giấy lọc để tránh bụi khi chưa gắn ngay lên lam kính.
Bước 2 làm tiêu bản: - Gắn lát cắt lên lam kính:
+ Cần phải chuẩn bị dung dịch Albumin lòng trắng trứng để làm chất gắn lát cắt chặt vào lam: lòng trắng trứng được đánh kỹ, hớt bỏ bọt, trộn với glycerin với tỷ lệ 1:1 rồi đem lọc, cho vào dung dịch một vài tinh thể thymol để chống nhiễm khuẩn. Dung dịch này có thể sử dụng được trong thời gian khá dài.
+ Bôi Albumin lên lam kính, lau đầu ngón tay bằng cồn, để khô rồi dùng đầu ngón tay bôi đều Albumin thật mỏng, hơ nóng khoảng 600 trên ngọn lửa đèn cồn.
+ Chuẩn bị một bát nước nóng khoảng 500, chọn một vài lát cắt phẳng nhất và lành nhất cho vào bát nước nóng để lát cắt dãn phẳng ra. Lấy lam đã bôi Albumin nhúng vào bát nước, đồng thời vớt lát cắt ra, gắn và chỉnh cho lát cắt vào giữa lam.
+ Để lam đã gắn mẫu vào tủ ấm 370C trong vòng 12 giờ hoặc để ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, tránh để bụi bám vào, sau đó mới đem xử lý loại parafin.
- Loại parafin: cho lam có mẫu qua Xilen II, Xilen I mỗi lần 15 – 20 phút để loại bỏ parafin, rồi chuyển vào cồn – xilen với tỷ lệ 1:1, cồn 1000, cồn 960, cồn 900, cồn 700, nước mỗi lần 2 – 3 phút để làm no mẫu nước.
- Nhuộm Hematoxylin và Eosin:
+ Dùng phương pháp nhuộm kép Hematoxylin và Eosin.
+ Nhuộm Hematoxylin trước trong vòng 15 – 20 phút, sau đó rửa dưới vòi nước chảy để làm xanh hoặc có thể biệt hóa bằng dung dịch cồn 960 và HCl với tỷ lệ 99:1 trong 1 – 2 giây và rửa nước lại.
+ Để ráo nước và nhuộm tiếp bằng Eosin 1% trong 10 – 15 phút, rồi rửa nước. + Sau mỗi lần nhuộm nên xem dưới kính hiển vi để xác định mẫu đã bắt màu đủ chưa hay quá nhiều, nếu chưa đủ thì nhuộm thêm, nếu nhuộm quá thì với Hematoxylin biệt hóa thêm bằng cồn và acid hoặc ngâm nước cho nhạt bớt; với Eosin thì ngâm nước hoặc cồn 700.
- Loại nước: chuyển nhanh tiêu bản qua cồn 700 trong 1 – 2 phút, rồi qua cồn 900, cồn 960, cồn 10001, cồn 10002 mỗi lần 2 – 3 phút.
- Làm trong tiêu bản: chuyển tiêu bản vào cồn – xilen với tỷ lệ 1:1, xilen I, xilen II mỗi lần 2 – 3 phút.
- Gắn lamen:
Tiêu bản được lấy từ ximen ra để khô, nhỏ lên vị trí có mẫu 1 giọt Bôm Canada, từ từ hạ lamen xuống cho tiếp xúc với giọt Bôm, khi giọt Bôm đã lan hết ra xung quanh, nhỏ 1 ít xilen lên mép lamen để dịch đẩy hết bọt khí ra. Cho lamen vào tủ ấm 37 – 400C trong 3 – 4 ngày để khô, rồi dán nhãn cho tiêu bản.