CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. ĐỊA ĐIỂM, PHẠM VI VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
* Phân lập từ thân, lá
Rửa mẫu thân, lá trong nước để loại bỏ đất bụi và các tạp chất khác.
Khử trùng bề mặt mô lá hoặc thân bằng cách dùng bông đã khử trùng thấm cồn 70% lau bề mặt thân, lá hoặc nhúng nhanh vào cồn 70% trong 5 giây, rửa lại trong nước cất vô trùng và để khô trên giấy thấm vô trùng. Sau đó dùng kéo cắt thành từng đoạn nhỏ 2 x 2 mm từ phần ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh, tiến hành cấy mẫu trên môi trường WA. Đặt các đĩa petri đã cấy mẫu bệnh trong tủ ấm ở nhiệt độ 280C trong 2 - 3 ngày để cho sợi nấm phát triển trên môi trường. Khi nấm bệnh đã mọc, tiến hành cấy chuyền sang môi trường PDA.
* Phân lập từ rễ
Rửa mẫu rễ trong nước để loại bỏ đất và các tạp chất. Gọt bỏ lớp vỏ ngoài của rễ vì phần này thường chứa vi sinh vật hoại sinh. Mô cấy được lấy từ phần ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh. Phun xịt mẫu bằng cồn 70%. Cắt
những miếng mô mỏng và cấy lên môi trường WA, khi nấm mọc tiến hành cấy chuyền sang môi trường PDA.
* Phân lập nấm bệnh cây từ đất
Cân 10g đất cho vào bình tam giác chứa 90ml dung dịch nước muối sinh lý vô trùng, lắc mẫu trên máy lắc ngang với tốc độ 100 vòng/phút trong thời gian 15 phút. Dịch mẫu thu đƣợc có độ pha loãng 10-1.
Dùng pipet vô trùng hút 1ml dung dịch trên cho sang ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng lắc đều, ta được dung dịch có độ pha loãng là 10-2. Tiếp tục pha loãng mẫu đến độ pha loãng 10-3, 10-4,… Lấy 0,1ml dịch mẫu cho vào các đĩa petri có chứa môi trường WA vô trùng. Sau đó dùng que trang đều giọt dịch trên mặt thạch. Nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 28 - 300C trong 3 - 5 ngày để tạo thành các khuẩn lạc riêng rẽ. Chọn các khuẩn lạc điển hình cấy chuyền sang môi trường PDA đến khi thuần chủng. Bảo quản giống ở nhiệt độ 4 - 60C.
b. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật [5]
Số lượng tế bào sống trong các cơ chất phân lập trên môi trường dinh dƣỡng đặc đƣợc biểu thị bằng đơn vị CFU (Colony Forming Unit), 1 CFU tương ứng với 1 khuẩn lạc phát triển từ 1 tế bào ban đầu của 1 loại vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng trong đĩa thạch. Tính số lượng tế bào vi sinh vật trong 1g cơ chất theo công thức:
W Df A
N n (2.1)
Trong đó:
N: tổng số CFU/g mẫu
A: số lƣợng khuẩn lạc trung bình trên 1 hộp petri ở từng độ pha loãng
n: số giọt dung dịch trung bình trong 1ml dịch pha loãng Df: Độ pha loãng
W: Trọng lƣợng khô của 1g mẫu
c. Phương pháp phân loại sơ bộ các chủng nấm mốc gây bệnh
- Sử dụng các khóa phân loại của Keith Seifert (1996), S. B. Marthu Olga Kongsdal (2000) [6]; khóa phân loại nấm mốc của Bùi Xuân Đồng (1984) [8] và hệ thống phân loại nấm bệnh hại cây trồng của Vũ Triệu Mân (2007) [11], [17].
- Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên thạch đĩa + Hình dạng
+ Dạng mặt (nhung mƣợt, mịn, len xốp, dạng hạt, lồi lõm, có khía hay không…)
+ Màu sắc khuẩn lạc mặt trên và mặt dưới
+ Dạng mép khuẩn lạc (mỏng, dày, phẳng, nhăn nheo…) + Giọt tiết nếu có (nhiều, ít, màu sắc)
+ Mùi khuẩn lạc (có, không mùi)
+ Sắc tố hoà tan (màu của môi trường xung quanh khuẩn lạc) nếu có.
- Quan sát các đặc điểm vi học dưới kính hiển vi quang học + Sợi nấm: (hyphae) có vách ngăn, không có vách ngăn, có mấu + Bào tử trần (conidia)
+ Bộ máy mang bào tử (spore apparatus)
+ Bộ máy mang bào tử trần (conidiogenous apparatus) + Tế bào sinh bào tử trần (conidiogenous cell)
d. Phương pháp lây bệnh nhân tạo xác định chủng nấm gây bệnh Chúng tôi sử dụng phương pháp lây bệnh nhân tạo theo Lester W.
Burgess, Timothy E. Knight, Len Tesoriero và Phan Thúy Hiền (2009) 6].
Phương pháp lây bệnh vào đất: Lây nhiễm nấm bệnh gây thối rễ và vàng lá cây hồ tiêu bằng phương pháp hỗn hợp. Phương pháp này yêu cầu nhân sinh khối nấm bệnh trên một giá thể tự nhiên nhƣ hạt thóc trong thời gian khoảng 1 - 2 tuần.
- Chuẩn bị sinh khối nấm bệnh:
+ Ngâm hạt thóc trong nước sạch khoảng 12 - 14 giờ để hạt thóc ngấm nước. Chắt bỏ phần nước, vớt thóc ra. Sau đó luộc chín sao cho độ nở hạt thóc khoảng 1/3, kiểm tra không còn lõi trắng ở giữa là đạt yêu cầu. Để thóc nguội và cho vào bình tam giác, làm nút bông và hấp thanh trùng ở chế độ nhiệt 1210C/1,5 - 2giờ.
+ Cấy nấm bệnh vào môi trường hạt thóc đã chuẩn bị
+ Nuôi sinh khối nấm bệnh ở 25 - 300C trong thời gian 7 ngày.
- Trộn sinh khối nấm bệnh vào đất để trồng hồ tiêu
- Chuẩn bị lô đối chứng: không trộn sinh khối nấm bệnh vào đất.
- Đặt các thùng xốp trồng hồ tiêu trong nhà lưới, tránh ánh nắng trực tiếp.
- Kiểm tra và so sánh những cây hồ tiêu đƣợc lây bệnh với những cây đối chứng. Quan sát, ghi nhận các triệu chứng và so sánh những triệu chứng này với các triệu chứng quan sát được trên vườn hồ tiêu.
e. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của nấm Phytophthora gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu
* Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của nấm Phytophthora [6]
Sau khi phân lập thuần chủng nấm Phytophthora tiến hành cấy chuyền nấm sang đĩa petri có chứa các loại môi trường khác nhau: PDA, CMA, WA, V8 - Juice. Nuôi ủ các mẫu nấm trên để ở nhiệt độ 250C.
Các đặc điểm hình thái nấm được theo dõi thường xuyên sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ sau khi cấy. Mỗi công thức (môi trường) có 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại là 1 đĩa petri. Theo dõi màu sắc (môi trường, khuẩn lạc), hình thái khuẩn lạc, đo đường kính khuẩn lạc (mm).
* Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của nấm Phytophthora trên môi trường dinh dưỡng PDA [6]
Nấm bệnh được nuôi cấy trên môi trường PDA ở các ngưỡng nhiệt độ khác nhau: 15, 20, 25, 30, 35, 400C. Mỗi ngƣỡng nhiệt độ có 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại là 1 đĩa petri. Đo đường kính khuẩn lạc (mm).
* Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường đến sự sinh trưởng của nấm Phytophthora trên môi trường dinh dưỡng PDA [6]
- Các ngƣỡng pH thí nghiệm là 3, 4, 5, 6, 7.
- Chuẩn bị môi trường PDA với các ngưỡng pH trên.
- Cách đo pH: mỗi cốc môi trường tối thích cho viên khuấy từ vào để khuấy môi trường tan đều, cho máy đo pH vào cốc, bật công tắc điện cho quay. Điều chỉnh đến pH cần nghiên cứu, nếu cần pH < 6 tiến hành thêm HCl vào, nếu cần pH > 6 cho thêm NaOH vào. Sau khi đạt đƣợc pH ở các ngƣỡng khác nhau, tiến hành bọc miệng cốc bằng giấy bạc, rồi cho vào nồi hấp ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1,5 atm, thời gian 25 phút. Khi cốc môi trường đã nguội (550C), rót ra đĩa petri, để hôm sau tiến hành cấy nấm. Mỗi công thức có 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại là 1 đĩa petri. Đo đường kính khuẩn lạc (mm) sau 3, 5, 7 ngày nuôi cấy nấm.
f. Phương pháp nghiên cứu thành phần cơ giới và độ ẩm đất
* Phương pháp nghiên cứu thành phần cơ giới đất [14]
Sử dụng phương pháp của NA. Katrinski (1965) áp dụng cho đất Việt Nam, phân loại đất dựa theo hàm lƣợng sét vật lý (cấp hạt < 0,002mm).
- Cách tiến hành:
Cân 10g đất cho vào 1 lít nước, lắc 16 giờ với tốc độ 125 vòng/phút.
Chuyển huyền phù đất vào ống trụ 1 lít. Để yên ống trụ sau 4 giờ ở 280C.
Lấy 1 thể tích nước ở độ sâu thích hợp (cm) cho vào cốc và sấy khô ở 1050C.
Bảng 2.1. Phân loại đất theo hàm lượng sét vật lý cấp hạt < 0,002mm Hàm lƣợng sét vật lý (%) đất vàng và
đất đỏ Tên gọi theo thành phần cơ giới
0 - 5 Cát rời (Cr)
5 - 10 Cát dính ( Cd)
10 - 20 Cát pha (Cp)
20 - 30 Thịt nhẹ (Tnh)
30 - 45 Thịt trung bình (Ttr)
45 - 60 Thịt nặng (Tn)
60 - 75 Sét nhẹ (Snh)
75 - 85 Sét trung bình (Str)
>85 Sét nặng (Sn)
Tính kết quả theo công thức:
% Sét =
m V
K S
. . 100 . . 1000
(2.2)
Trong đó: S: Khối lƣợng sét trong mẫu (g) V: Thể tích huyền phù hút (ml)
M: khối lƣợng mẫu đất (g) K: hệ số khô kiệt
* Xác định độ ẩm đất [14]
Sấy 5g đất đến khối lƣợng không đổi ở 1050C ± 50C, sự chênh lệch về khối lượng của đất trước và sau khi sấy được dùng để tính hàm lượng theo khối lƣợng.
Phần trăm độ ẩm tính theo công thức
A(%) =
3 2
2 1
P P
P P
x 100 (2.3) Trong đó:
P1: Khối lượng hộp thủy tinh có đất trước khi sấy (g) P2: Khối lƣợng hộp thủy tinh có đất sau khi sấy (g) P3: Khối lƣợng hộp thủy tinh không có đất (g)
g. Phương pháp nghiên cứu thử nghiệm khả năng ức chế nấm bệnh bằng nấm đối kháng Trichoderma
* Phân lập các chủng nấm Trichoderma trên môi trường PDA
Cách tiến hành: lấy 0,1ml dịch mẫu cho vào đĩa petri chứa môi trường PDA. Sau đó dùng que cấy trang dàn đều giọt dịch trên mặt thạch, cấy lặp
lại từ 2 – 3 đĩa. Đặt các đĩa petri cấy mẫu vào tủ ấm ở nhiệt độ 300C, sau 3 – 5 ngày chọn khuẩn lạc đặc trưng của nấm Trichoderma cấy sang môi trường thạch nghiêng đến khi thuần chủng.
* Phương pháp thử tính đối kháng [10]
- Môi trường thử tính đối kháng là môi trường PDA - Cách tiến hành:
+ Đổ môi trường PDA vào đĩa petri, kiểm tra độ vô trùng sau 24 giờ + Kẻ 1 đường giữa đĩa petri (phần đáy)
+ Cấy nấm Trichoderma và chủng nấm bệnh lên đường kẻ sao cho đối xứng nhau
+ Song song đó chuẩn bị 1 đĩa nấm bệnh độc lập để đối chứng
+ Đƣa vào nuôi ủ ở nhiệt độ 300C, đọc kết quả sau 4 – 5 ngày đối với nấm bệnh.
+ Hoạt tính kháng nấm được xác định thông qua đường kính khuẩn lạc nấm bệnh trên đĩa đối chứng không có nấm và đĩa kiểm tra có chứa nấm Trichoderma và quan sát tốc độ phát triển hệ sợi nấm Trichoderma. Đánh giá khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma phân lập đƣợc đối với nấm bệnh.
Đánh giá mức độ đối kháng của nấm Trichoderma theo phương pháp Nguyễn Thị Thuần et al., (1996); Trần Kim Loang et al., (2009) nhƣ sau:
H(%) = dB
d dB
x 100 (2.4) Trong đó:
H: Hiệu quả ức chế
d: đường kính khuẩn lạc nấm bệnh sau khi đạt hiệu quả đối kháng ở mức tối đa
dB: đường kính khuẩn lạc nấm bệnh ban đầu Ghi nhận kết quả đối kháng theo quy ƣớc:
+ Mức 4+: Hệ sợi nấm Trichoderma mọc sang khuẩn lạc của nấm bệnh. Hệ sợi của nấm bệnh đồng thời bị ức chế và tàn lụi dần. Hiệu quả ức chế >90%
+ Mức 3+: tương tự (1+), hiệu quả ức chế 80 - 90%
+ Mức 2+: tương tự (1+), hiệu quả ức chế 60 – 80%
+ Mức 1+: tương tự (1+), hiệu quả ức chế từ 40 – 60%
- : ngoài các trường hợp trên
h. Phương pháp nghiên cứu thử nghiệm hiệu quả phòng trừ bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu bằng chế phẩm đối kháng nấm Trichoderma
Sau khi tuyển chọn các chủng nấm Trichoderma đối kháng ở nghiên cứu trên, tiếp tục sử dụng chủng có hoạt tính đối kháng mạnh nhất nuôi cấy tạo chế phẩm dạng bột.
- Chuẩn bị chế phẩm Trichoderma trên môi trường hạt thóc.
- Cách tiến hành nhƣ sau:
+ Giá thể hạt thóc được chuẩn bị theo phương pháp chuẩn bị giá thể nấm bệnh (mục d)
+ Chuyển sinh khối nấm Trichoderma trong ống nghiệm vào túi nilon có chứa giá thể hạt thóc đã xử lý.
+ Đƣa vào phòng nuôi ủ ở nhiệt độ 300C cho đến khi bào tử màu xanh của nấm ăn kín túi giá thể.
+ Sau đó đƣa đi sấy khô ở nhiệt độ 350C cho đến khi độ ẩm còn khoảng 12%, cho vào máy xay mịn và đóng gói để tiếp tục thử nghiệm hiệu quả.
Thí nghiệm hiệu quả phòng trừ nấm gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu Tiên Phước 6 tháng tuổi sạch bệnh trong điều kiện nhà lưới.
Bố trí thí nghiệm với 4 công thức nhƣ sau:
- CT1: Xử lý bột giá thể nuôi cấy không có chế phẩm Trichoderma - CT2: Xử lý có chế phẩm đối kháng Trichoderma
- CT3: Xử lý dịch bào tử nấm bệnh + bột giá thể