CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.5. NGHIÊN CỨU LÂY BỆNH NHÂN TẠO TRÊN CÂY HỒ TIÊU
Chúng tôi tiến hành lây bệnh vào đất nhằm kiểm chứng các chủng vi nấm gây bệnh chính trên cây hồ tiêu Tiên Phước. Sau khi nhân sinh khối nấm Phytophthora (VT1) gây bệnh thối rễ và nấm Fusarium (VT13) gây bệnh vàng lá trên môi trường hạt thóc, nuôi ủ ở 250C trong 7 ngày, sau đó trộn sinh
khối nấm bệnh vào đất trồng cây hồ tiêu 6 tháng tuổi. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.8 và hình 3.7.
Bảng 3.8. Lây nhiễm các chủng nấm bệnh Phytophthora (VT1) và Fusarium (VT13) lên cây hồ tiêu Tiên Phước
Chỉ tiêu
theo dõi Mẫu ĐC Xử lý nấm bệnh Phytophthora
Xử lý nấm bệnh Fusarium
Số cây TN 6 6 6
Thời kỳ
tiềm dục 0 10 ngày 21 ngày
Số cây bị
bệnh 0 5 4
Tỷ lệ bệnh
(%) 0 83,3 63,6
Triệu chứng
bệnh
Cây phát triển bình thường, lá xanh, đỉnh sinh trưởng
phát triển khỏe hình thành lá non bình thường.
Sau 10 ngày, cây bắt đầu có lá héo và chuyển
lá vàng, sau 5 ngày tiếp theo lá rụng dần, thân chuyển màu thâm đen từ đỉnh sinh trưởng và chết, nhổ rễ lên quan sát có biểu hiện màu
thâm đen.
Cây phát triển yếu, đỉnh sinh trưởng không có khả năng sinh trưởng, lá
bắt đầu chuyển sang vàng nhạt sau đó đốm vàng rõ, lá dễ rụng khỏi
thân, phần gốc chuyển sang màu đục.
Kết quả lây nhiễm nhân tạo từ bảng 3.8 và hình 3.7 cho thấy thời gian ủ bệnh của chủng nấm Phytophthora VT1 là 10 ngày và tỉ lệ gây bệnh khá cao lên đến 83,3%, trong khi đó nấm Fusarium VT13 có thời gian ủ bệnh đến 21 ngày và tỉ lệ gây bệnh đạt ở mức 63,6%.
Quan sát triệu chứng biểu hiện bệnh khi thực hiện lây bệnh nhân tạo, kết quả hiện tƣợng bệnh khá giống với hiện tƣợng bệnh quan sát ngoài đồng ruộng. Điều này chứng minh, bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora VT1 và bệnh chết chậm do nấm Fusarium VT13 gây ra trên cây hồ tiêu Tiên Phước.
Đối chứng Lây nhiễm nấm bệnh Phytophthora
Đối chứng Lây nhiễm nấm bệnh Fusarium Hình 3.7. Cây hồ tiêu được lây nhiễm nấm Phytophthora VT1 và
Fusarium VT13 sau 25 ngày trong điều kiện nhà lưới
3.6. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG NẤM PHYTOPHTHORA VT1 PHÂN LẬP TỪ CÂY HỒ TIÊU
Bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora sp. gây ra là loại bệnh nguy hiểm nhất cho cây hồ tiêu hiện nay tại huyện Tiên Phước, vì khi nhiễm loại nấm Phytophthora sp. vào rễ làm cho cây bắt đầu suy yếu, lá héo rũ và rụng nhanh do rễ bắt đầu thối, cây chết nhanh trong vòng 7 – 14 ngày từ khi có biểu hiện bệnh. Khi trong vườn có 1 cây bị nhiễm nấm này thì khả năng lây lan là rất nhanh và mạnh, khi bệnh đã xuất hiện thì không có loại thuốc nào đặc trị.
Theo kết quả phân lập các mẫu rễ trên cây hồ tiêu bị bệnh chết nhanh tại các xã của huyện Tiên Phước đều có sự hiện diện của nấm Phytophthora.
Do hạn chế về thời gian nên chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng nấm Phytophthora VT1 làm cơ sở cho việc đề xuất các giải pháp thích hợp trong công tác phòng bệnh chết nhanh cho hồ tiêu.
3.6.1. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của nấm Phytophthora VT1
Để xác định môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng của nấm Phytophthora VT1, chúng tôi tiến hành cấy chúng trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau (gồm 4 môi trường: PDA, CMA, V-8 và WA) trên đĩa petri, nuôi ủ trong cùng điều kiện nhiệt độ 280C và tiến hành đo kích thước khuẩn lạc sau thời gian: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ. Kết quả thu đƣợc thể hiện ở bảng 3.9 và hình 3.8, 3.9.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của nấm Phytophthora VT1
Môi trường
Hình dạng khuẩn lạc
Màu sắc khuẩn lạc
Đường kính khuẩn lạc trung bình (mm)
24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ WA Hình bông vải,
sợi mảnh Trắng 8,0b 13,3b 19,7d 26,7c PDA Hình bông vải,
xốp Trắng 10,7a 22,7a 36a 49,0a
CMA Hình bông vải,
xốp Trắng 9,0ab 21,3a 30,7b 42,0b V8-
juice
Hình bông không xốp
Hồng
nhạt 7,7b 15,0b 24,3c 29,3c
* Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê theo Duncan’s test (p<0,05).
Hình 3.8. Kích thước đường kính khuẩn lạc Phytophthora VT1 trên các môi trường dinh dưỡng
Hình 3.9. Khuẩn lạc nấm Phytophthora VT1 trên một số môi trường dinh dưỡng sau 72 giờ nuôi cấy
Qua kết quả bảng 3.9 và hình 3.8, 3.9, chúng tôi có một số nhận xét nhƣ sau:
- Nấm Phytophthora VT1 có khả năng sinh trưởng được trên cả 4 loại môi trường. Trên môi trường PDA và CMA, khuẩn lạc Phytophthora VT1 có hình bông vải, xốp; trên môi trường V8, khuẩn lạc Phytophthora VT1 có màu hồng nhạt, sợi nấm mọc áp sát bề mặt thạch; đặc biệt trên môi trường WA khuẩn lạc Phytophthora VT1 có màu trắng, sợi nấm rất mảnh có thể do môi trường nghèo dinh dƣỡng, điều này giải thích tại sao nấm Phytophthora VT1 vẫn phát triển được trên các vùng đất khô cằn, nghèo dinh dưỡng của huyện Tiên Phước.
- Sau 96 giờ nuôi cấy, trên môi trường PDA nấm Phytophthora VT1 sinh trưởng mạnh nhất, đường kính nấm đạt trung bình tối đa là 49 mm, sự sinh trưởng của nấm yếu hơn trên môi trường CMA, đường kính khuẩn lạc đạt trung bình 42 mm và sinh trưởng yếu trên môi trường V8- juice và môi trường WA, kích thước đường kính khuẩn lạc đạt trung bình 29,3 mm và 26,7 mm. Tuy
PDA
CMA V-8
WA
nhiên, nếu xét về hàm lƣợng dinh dƣỡng cho thấy nấm Phytophthora VT1 phát triển tốt cả trong điều kiện nghèo dinh dƣỡng, điều này chứng tỏ nấm Phytophthora VT1 có khả năng thích ứng mạnh trong các loại đất từ loại đất giàu dinh dƣỡng đến các loại đất nghèo dinh dƣỡng nhất.
Dựa vào khóa phân loại nấm bệnh thực vật của Vũ Triệu Mân (2007) [18] và hình thái khuẩn lạc của chủng Phytophthora VT1 trên môi trường PDA, chúng tôi tiến hành quan sát đặc điểm hình thái hệ sợi, cuống sinh bào tử và các dạng bào tử dưới kính hiển vi, kết quả được trình bày ở bảng 3.10 và hình 3.10.
Bảng 3.10. Đặc điểm hình thái của nấm Phytophthora VT1 phân lập từ rễ cây hồ tiêu bị bệnh chết nhanh tại một số xã của huyện Tiên Phước
STT Chỉ tiêu Đặc điểm
1 Hình thái khuẩn lạc nấm trên môi trường PDA
Hình thái tản nấm có hình bông vải, có màu trắng, xốp
2 Sợi nấm trên môi trường PDA
Đơn bào, không có vách ngăn, phân nhánh gần thẳng góc, đôi khi có nốt phồng trên sợi nấm
3 Bọc bào tử động
(Sporangium)
- Hình dạng Có dạng hình quả chanh hoặc quả lê có núm ở đầu
- Núm bọc bào tử:
+ 1 núm + Đa số có một núm
+ 2 núm + Ít
STT Chỉ tiêu Đặc điểm
+ 3 núm + Không có
- Đặc điểm núm bọc bào tử + Núm nổi rõ - Sự rụng của bọc bào tử
khỏi cành bọc bào tử
+ Bền, không rụng
4
Hậu bào tử
(Chlamydospore)
- Số lƣợng Hình thành nhiều
- Vị trí hình thành Hình thành ở đầu và ở giữa sợi nấm
Khuẩn lạc nấm Phytophthora Sợi nấm và nốt phồng trên sợi nấm
Bào tử Bọc bào tử động
Hình 3.10. Hình ảnh tản nấm, bào tử động, bào tử và nốt sần trên sợi nấm Phytophthora VT1
Nhƣ vậy, đặc điểm hình thái khuẩn lạc này hoàn toàn phù hợp với kết quả miêu tả hình thái nấm Phytophthora sp. Nguyễn Tăng Tôn (2009) [23] khi nghiên cứu vi nấm gây bệnh chết nhanh tại một số vùng trồng hồ tiêu tại Cam Lộ - Quảng Trị và Tây Nguyên.
3.6.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của nấm Phytophthora VT1
Kết quả nghiên cứu về động thái phân bố vi nấm gây bệnh trên cây hồ tiêu theo thời gian, cho thấy sự sinh trưởng của các loài vi nấm phụ thuộc rất lớn vào điều kiện ngoại cảnh trong đó yếu tố nhiệt độ là một trong những yếu tố rất quan trọng, quyết định đến sự phát sinh, phát triển của nấm gây bệnh trên đồng ruộng. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đối với một số vi nấm nhằm xác định đƣợc chu kỳ phát triển của bệnh và có biện pháp phòng trừ hợp lý (Agrios G.N, 2004) [32].
Do vậy, để xác định ngưỡng nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của nấm Phytophthora VT1 làm cơ sở phòng tránh bệnh phát sinh trên cây hồ tiêu, chúng tôi tiến hành nuôi cấy nấm Phytophthora VT1 ở một số ngƣỡng nhiệt độ (15, 20, 25, 30, 35, 400C) trên môi trường PDA. Đo kích thước đường kính khuẩn lạc nấm Phytophthora VT1 phát triển theo các ngưỡng nhiệt độ sau 3 ngày, 5 ngày và 7 ngày. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.11 và hình 3.11, 3.12.
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của sợi nấm Phytophthora VT1 trên môi trường PDA
Nhiệt độ (0C) Đường kính khuẩn lạc trung bình (mm)
3 ngày 5 ngày 7 ngày
15 4,3d 10,0d 22,3c
20 12,0c 22,3c 49,3b
25 36,7a 61,3a 89,0a
30 34,0a 56,0b 81,0b
35 10,3c 21,7c 46,7c
40 0 0,7e 1,7d
* Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê theo Duncan’s test (p<0,05).
Hình 3.11. Đường kính khuẩn lạc nấm nấm Phytophthora VT1 trên môi trường PDA theo các khoảng nhiệt độ
Kết quả bảng 3.11 và hình 3.11, 3.12 cho thấy nấm Phytophthora VT1 gây hại trên cây hồ tiêu tại huyện Tiên Phước đều có khả năng sinh trưởng và phát triển đƣợc trong khoảng nhiệt độ từ 15 – 350C, trong đó hệ sợi nấm sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 25 – 300C. Sau 7 ngày nuôi cấy, ở nhiệt độ 250C kích thước đường kính khuẩn lạc là cao nhất, đạt trung bình: 89 mm; ở nhiệt độ 350C và 200C tốc độ phát triển của nấm chậm hơn, đường kính khuẩn lạc đạt trung bình: 49,3 – 81,0 mm, ở nhiệt độ 150C khuẩn lạc nấm sinh trưởng yếu nhất, đạt trung bình 22,3 mm và khuẩn lạc nấm bị ức chế ở nhiệt độ 400C.
Nhƣ vậy, điều kiện nhiệt độ thích hợp cho các loài nấm gây hại trên cây hồ tiêu phát triển cũng là khoảng nhiệt độ trung bình hàng năm của huyện Tiên Phước là 25 – 300C. Kết quả này đồng thời khẳng định nấm Phytophthora VT1 phát triển mạnh vào các tháng đầu mùa mƣa có điều
Hình 3.12. Đường kính khuẩn lạc nấm Phytophthora VT1 nuôi cấy trên môi trường PDA ở các ngưỡng nhiệt độ sau 5 ngày nuôi cấy
200C 300C
250C 350C 150C
400C
kiện nhiệt độ thấp theo kết quả nghiên cứu động thái phân bố theo thời gian là hoàn toàn phù hợp.
3.6.3. Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự sinh trưởng của nấm Phytophthora VT1
Sự lan truyền và xâm nhiễm bệnh của nấm Phytophthora sp. chủ yếu là bào tử, tuy nhiên việc xâm nhập vào đƣợc mô ký chủ để gây bệnh hay không còn phụ thuộc vào sự nảy mầm của bào tử, vấn đề này phụ thuộc chặt chẽ vào các yếu tố môi trường. Hầu như tất cả các loại nấm ký sinh chuyên tính đều phụ thuộc vào pH của ký chủ, vì vậy việc nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của nấm Phytophthora sp. là cần thiết (Agrios G.N, 2004) [32].
Để xác định pH môi trường thích hợp cho sự phát triển của nấm Phytophthora VT1, chúng tôi tiến hành nuôi cấy nấm ở các ngƣỡng pH khác nhau (3, 4, 5, 6, 7) trên môi trường PDA, nhiệt độ: 250C và đo kích thước đường kính khuẩn lạc nấm Phytophthora VT1 sau 3 ngày, 5 ngày và 7 ngày. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.12 và hình 3.13.
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự sinh trưởng của sợi nấm Phytophthora VT1 trên môi trường PDA
pH môi trường Đường kính khuẩn lạc trung bình (mm)
3 ngày 5 ngày 7 ngày
3 0,85d 13,0d 20,0e
4 21,7c 41,0c 62,0c
5 36a 60,3a 85,7a
6 26,0b 48,7b 69,3b
7 CV%
19,7c 37,0c 46,7d
* Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê theo Duncan’s test (p<0,05).
Hình 3.13. Đường kính khuẩn lạc của nấm Phytophthora VT1 theo các ngưỡng pH khác nhau trên môi trường PDA
Kết quả bảng 3.12 và hình 3.12, 3.13 cho thấy nấm Phytophthora VT1 đều có khả năng sinh trưởng trên 5 ngưỡng pH thử nghiệm, trong khoảng pH
= 4 – 6 là thích hợp nhất, đường kính khuẩn lạc sau 7 ngày nuôi cấy đạt trung bình là (62 – 85,9) mm và đường kính khuẩn lạc đạt trung bình cao nhất là 85,9 mm ở môi trường có pH = 5. Trên môi trường axit mạnh (pH = 3) nấm vẫn có khả năng sinh trưởng nhưng rất yếu, đường kính khuẩn lạc đạt chỉ đạt trung bình 20 mm; sợi nấm sinh trưởng yếu dần trên môi trường trung tính (pH = 7) chỉ đạt 46,7 mm sau 7 ngày nuôi cấy.
Như vậy, nấm Phytophthora VT1 có khả năng sinh trưởng trên phạm vi pH khá rộng từ 3 -7 và ở môi trường có pH = 5 tốc độ sinh trưởng của nấm mạnh nhất và phát triển yếu nhất trên môi trường có pH = 3.
Điều này chứng minh các chủng vi nấm gây bệnh trên hồ tiêu có khả năng sinh trưởng và phát triển trên môi trường đất chua tại huyện Tiên Phước, kết quả này phù hợp với kết quả của Nguyễn Tăng Tôn (2009) [23] khi nghiên cứu ngƣỡng pH tốt nhất cho sự phát triển của nấm Phytophthora ở Tây Nguyên là pH = 4 – 5.
Kết quả nghiên cứu cho thấy nấm Phytophthora phát triển tốt trên môi trường là axit và phát triển yếu dần trên môi trường trung tính. Do đó, để hạn chế bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu tại huyện Tiên Phước do nấm Phytophthora gây ra phải thường xuyên bón vôi để cải tạo pH môi trường đất.
3.7. THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM BỆNH BẰNG NẤM TRICHODERMA ĐỐI KHÁNG
Nhiều nghiên cứu cho thấy nấm Trichoderma đƣợc ứng dụng rất nhiều trong việc bảo vệ cây trồng chống các nấm và vi khuẩn gây bệnh, do nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm gây bệnh cây trồng thông qua nhiều cơ chế nhƣ: ký sinh, sinh chất kháng sinh và enzym phân hủy vách tế bào của nấm bệnh.
Để có cơ sở đề xuất giải pháp phòng trừ nấm bệnh bằng các tác nhân sinh học hiệu quả cho các vườn hồ tiêu tại huyện Tiên Phước, chúng tôi tiến hành phân lập nấm đối kháng Trichoderma và đánh giá hiệu lực ức chế của chúng đến khuẩn lạc các chủng nấm bệnh trên hồ tiêu trong điều kiện in vitro.
Sau khi phân lập 40 mẫu đất thịt trung bình lấy tại các vườn hồ tiêu xã Tiên Châu trên môi trường PDA đã thu được 10 chủng Trichoderma ký hiệu là: Tr1 – Tr10.
Tiến hành thử khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma (Tr1- Tr10) đối với các nấm bệnh: Phytophthora, Fusarium, Phythium theo phương pháp của Trần Kim Loang et al., (2009) [15]. Kết quả thể hiện ở bảng 3.13 và hình 3.14 nhƣ sau:
Bảng 3.13. Mức độ đối kháng của nấm Trichoderma với một số nấm bệnh trên cây hồ tiêu
Chủng nấm Trichoderma
Mức độ đối kháng Nấm bệnh kiểm định
Fusarium Phytophthora Phythium
Tr1 + ++ +++
Tr2 +++ ++++ ++++
Tr3 +++ ++ ++
Tr4 +++ ++ +
Tr5 + +++ +++
Tr6 - + +
Tr7 ++ + -
Tr8 + + -
Tr9 +++ ++ +
Tr10 - + +
* Chú thích:
4+: Hiệu quả ức chế >90% 3+: Hiệu quả ức chế 80 - 90%
2+: Hiệu quả ức chế 60 – 80% 1+: Hiệu quả ức chế từ 40 – 60%
-: Ngoài các trường hợp trên
Hình 3.14. Mức độ đối kháng nấm Trichoderma Tr2 với các chủng nấm bệnh: Phytophthora, Fusarium, Phythium
Kết quả bảng 3.13 cho thấy sau 4 ngày nuôi cấy cả 10 chủng Trichoderma (Tr1 – Tr10) đều có khả năng kháng nấm bệnh (Phytophthora, Fusarium và Phythium) trên cây hồ tiêu. Tuy nhiên, xét về mức độ kháng của từng chủng thì có sự khác nhau, cụ thể:
- Chủng Trichoderma Tr1 có đối kháng cao nhất mức 4+ chỉ với nấm Fusarium
- Chủng Trichoderma Tr3 có mức đối kháng cao nhất 3+ đối với nấm Fusarium và Phythium
- Chủng Trichoderma Tr4 và Tr9: có mức đối kháng cao nhất 4+ với nấm Fusarium, mức đối kháng 3+ với nấm Phytophthora và mức đối kháng 1+ với nấm Phythium
- Chủng Trichoderma Tr5: có mức đối kháng cao nhất 3+ với nấm Phythium và Phytophthora, nhƣng đối kháng với nấm Fusarium chỉ mức1+
- Các chủng Trichoderma Tr6, Tr7, Tr8 và Tr10: có mức đối kháng nấm bệnh yếu nhất ở mức đối kháng 1+, 2+ hoặc không đối kháng đƣợc với 1 số chủng nấm bệnh.
- Trong đó chú ý nhất là chủng Trichoderma Tr2 : có mức đối kháng mạnh trên cả 3 loại nấm bệnh, mức đối kháng 4+ trên nấm Phytophthora và Phythium, mức 3+ đối với nấm Fusarium (hình 3.15).
Hình 3.15. Hình thái khuẩn lạc và ống giống nấm Trichoderma Tr2 trên môi trường thạch nghiêng
3.8. THỬ NGHIỆM HIỆU QUẢ PHÒNG TRỪ BỆNH CHẾT NHANH TRÊN CÂY HỒ TIÊU TIÊN PHƯỚC BẰNG NẤM TRICHODERMA ĐỐI KHÁNG
Từ kết quả nghiên cứu khả năng đối kháng của nấm Trichoderma với nấm bệnh, chúng tôi tiến hành chọn chủng Trichoderma Tr2 có hoạt tính đối kháng mạnh nhất đối với nấm bệnh gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu để nuôi thu nhận sinh khối nấm (trên môi trường hạt thóc) với mật độ nấm Trichoderma Tr2 là 3.109CFU/g và dùng thử nghiệm hiệu quả phòng trừ đối với chủng nấm bệnh Phytophthora VT1.
Khuẩn lạc Ống giống trên thạch nghiêng
Để đánh giá hiệu quả phòng trừ bệnh chết nhanh do chủng nấm Phytophthora VT1 gây ra, chúng tôi tiến hành thí nghiệm lây bệnh nhân tạo trên cây hồ tiêu Tiên Phước 6 tháng tuổi trong điều kiện nhà lưới với 4 công thức (CT) nhƣ sau:
- CT1: Đất + cây hồ tiêu + môi trường hạt thóc
- CT2: Đất + cây hồ tiêu + chế phẩm nấm Trichoderma Tr2 - CT3: Đất + môi trường hạt thóc + nấm bệnh Phytophthora VT1
- CT4: Đất + cây hồ tiêu + dịch bào tử nấm Phytophthora VT1 + chế phẩm nấm Trichoderma Tr2
Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 3.14 và hình 3.16.
Bảng 3.14. Hiệu quả phòng trừ bệnh chết nhanh bằng chế phẩm Trichoderma Tr2 thô trong điều kiện nhà lưới
CT thí nghiệm
Số cây thí nghiệm
Số cây bị nhiễm
bệnh
Tỷ lệ bệnh (%)
Ngày lây bệnh
Ngày phát bệnh
Thời kỳ tiềm dục
(ngày)
CT1 6 0 0 30/9/2013 0 0
CT2 6 0 0 30/9/2013 0 0
CT3 6 5 83,3 30/9/2013 10/10/2013 10
CT4 6 1 16,6 30/9/2013 14/10/2013 15