2.1. Địa điểm thu mẫuvà nghiên cứu
Mẫu được thu tại đồi cát di động và đồi cát cố định vùng ven biển thành phố Phan Thiết.
Giải phẫu hiển vi được tiến hành tại phòng thí nghiệm Di truyền - Thực vật, trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh.
Hình 2.1. Đồi cát di động thuộc xã Hàm Tiến
Hình 2.2. Đồi cát cố định thuộc xã Tiến Thành
2.2. Thời gian thu mẫu Thu mẫu 2 lần:
-Lần 1: tháng 11/2013 - Lần 2: tháng 6/2014.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết
Thu thập một số tài liệu liên quan đến đề tài nghiên cứu để vận dụng vào phân tích, biện luận các kết quả đạt được.
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu ngoài thực địa 2.3.2.1. Khảo sát một số điều kiện sinh thái + Dùng ẩm kế để đo nhiệt độ và độ ẩm không khí
+ Lấy mẫu đất ở tầng 0 - 20cm và 20 - 40 cm để mô tả phẫu diện và phân tích thành phần cơ giới (do Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam phân tích).
2.3.2.2. Quan sát, mô tả hình thái cơ quan sinh dưỡng và cơ quan sinh sản - Quan sát, mô tả các cơ quan sinh dưỡng và cơ quan sinh sản của những loài thực vật nghiên cứu, đo đếm các bộ phận liên quan.
- Chụp ảnh các đối tượng nghiên cứu trong điều kiện tự nhiên.
2.3.2.3. Thu mẫu
Đối với cây thân thảo và cây bụi cỡ nhỏ: thu toàn bộ cơ quan sinh sản và sinh dưỡng.
Đối với cây thân bụi to: thu lá và hoa, quả.
- Rễ: lấy rễ đồng đều về kích thước, lấy toàn bộ chiều dài của rễ để quan sát được các dạng biến thái để thích nghi và dự trữ của rễ.
- Thân: thu các thân của cây có chiều cao tương đương nhau.
- Lá: chọn những lá có kích thước tương đương nhau. Nếu so sánh kích thước lá phải so sánh các lá ở cùng vị trí trên cành.
- Hoa, quả: thu mẫu trên cây, chọn mẫu có kích cỡ sinh trưởng tối đa, còn nguyên vẹn, chưa bị dập nát.
2.3.2.3. Phương pháp cố định mẫu
Các mẫu được giữ ẩm trong giấy báo đem về phòng thí nghiệm để nghiên cứu về giải phẫu hoặc cố định trong dung dịch focmon 5%.
2.3.3. Định loại các mẫu thực vật
Dựa vào tài liệu Cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ (1999-2003), Phân loại học thực vật của Hoàng Thị Sản (2008), Taxonomy of Angiosperms của Sambamurty (2005) và các trang web Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam, The Plant listđể định loại các loài thu được [4], [13], [35], [37].
2.3.4. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 2.3.4.1. Phương pháp đếm số lượng khí khổng
- Thoa một ít collodion ở 2 mặt của lá, tại cùng vị trí 1/3 lá tính từ gốc.
- Chờ khi collodion khô, gỡ ra, lên mẫu và xem trên kính hiển vi.
- Đếm số lượng khí khổng trong thị trường ở độ bội giác x40.
- Đường kính thị trường d=0,33mm
- Tính số khí khổng trên 1mm2 bằng công thức:
tt
y x
= S
Trong đó: x: số khí khổng trong thị trường ở bội giác x40 Stt: diện tích thị trường = 0,0855 (mm2)
y: số khí khổng có trên 1mm2
2.3.4.2. Phương pháp nghiên cứu giải phẫu cấu tạo thân, lá cây
- Cắt trực tiếp bằng tay với lưỡi dao lam với những mẫu mỏng, mềm như rễ, thân, lá của cây thân thảo, dùng máy cắt lát bằng tay với thân, rễ của cây thân bụi.
- Cắt xong sử dụng phương pháp nhuộm kép gồm các bước sau:
+ Vi mẫu sau khi cắt ngâm ngay vào dung dịch Javen trong 20 phút để tẩy sạch nội chất của tế bào, rửa sạch bằng nước cất.
+ Ngâm mẫu vào axit axetic 1% khoảng 5 phút để loại bỏ nước Javen còn dính lại, sau đó rửa lại bằng nước cất.
Hình 2.3. Vị trí quét collodion trên bề mặt lá.
+ Nhuộm đỏ bằng dung dịch carmin - phèn chua trong khoảng 20 phút, rửa lại bằng nước cất.
+ Nhuộm xanh bằng dung dịch xanh metylen loãng trong khoảng 5 - 10 giây, rửa sạch bằng nước cất.
+ Lên kính bằng glycerin để quan sát, phân tích, đo đếm.
- Mỗi cơ quan sinh dưỡng của một loài sẽ được tiến hành 10 - 15 lần ở các cây khác nhau, đối với cây thuộc lớp Ngọc lan là lá ở vị trí thứ 7 trên cành, cây 1 lá mầm là lá thứ 3 từ gốc [7].
2.3.4.3. Phương pháp đo trên kính hiển vi
Sử dụng phương pháp đo gián tiếp bằng cách so sánh kích thước của vật cần đo với một thước đo thị kính được lắp thêm vào kính hiển vi. Từ giá trị của mỗi khoảng cách trên thước đo này (đã được tính trước nhờ thước đo vật kính) sẽ suy ra kích thước vật đo.
Thước đo vật kính trông giống như phiến kính, ở chính giữa có khắc một thước nhỏ. Thước dài 1mm, được chia thành 100 phần bằng nhau, mỗi khoảng cách trờn đú dài 0,01mm hay 10 àm.
Thước đo thị kính được lắp ở đầu ống mang thị kính của kính hiển vi, trên có 100 vạch chia nhỏ.
Trước hết phải xác định giá trị của mỗi vạch trên thước đo thị kính (tính bằng àm) ở mỗi độ phúng to khỏc nhau của kớnh hiển vi. Muốn vậy ta đặt thước đo vật kính lên bàn kính rồi điều chỉnh để thấy rõ các vạch. Lắp thước đo thị kính vào sao cho một vạch trên thước đo thị kính trùng với một vạch trên thước đo vật kính. Ta tìm một vạch thứ hai nào cũng trùng như vậy. Ta có trị số một vạch trên thước đo thị kính là:
b d =10×a
Trong đó: d: Trị số một vạch trên thước đo thị kính a: Số vạch của thước đo vật kính
b: Số vạch của thước đo thị kính
10: Giỏ trị một khoảng cỏch trờn thước đo vật kớnh (àm)
Bằng cách này xác định được trị số mỗi vạch trên trắc vi thị kính ở vật kính 40: mỗi vạch dài 3,5àm
Bỏ thước đo vật kính ra và thay vào đó tiêu bản của mẫu vật cần đo [7].
2.3.5.Phương pháp phân tích và xử lí số liệu Dùng phần mềm Excel 2007để xử lí các số liệu.
Khi đo tiến hành với số lần n = 10 và tính giá trị trung bình (X ), sai số m. Số liệu được xử lí bằng phương pháp toán thống kê:
Tính giá trị trung bình:
n Xi X
n
1 i
∑=
= Với X : giá trị trung bình
∑= n
i
Xi
1
: tổng giá trị của X khi i=1n Tính độ lệch chuẩn:
1 )
1(
2
−
= ∑= − n
X
n Xi δ i
Tính sai số:
n m= δ