Qua quá trình nghiên cứu tôi có một số đề xuất cho những nghiên cứu tiếp theo như sau:
1. Nghiên cứu mở rộng dải nồng độ, tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch, thời gian và nhiệt độ trong quá trình xử lý mẫu để tăng độ chính xác của nghiên cứu cho công đoạn xử lý kiềm hoặc nước ấm trong quy trình sản xuất Collagen.
2. Nghiên cứu phương pháp phân tích xác định hàm lượng Collagen.
3. Tối ưu hóa công đoạn xử lý kiềm với hàm mục tiêu mở rộng hơn là: hiệu suất khử khoáng và/hoặc hiệu suất khử protein.
4. Nghiên cứu các công đoạn tiếp theo của qui trình sản xuất Collagen.
5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ (nhiệt độ lạnh ≤ 40C và nhiệt độ phòng) đến hiệu quả khử tạp chất, hàm lượng và chất lượng Collagen để chọn điều kiện nghiên cứu phù hợp với quy mô sản xuất công nghiệp.
6. Nghiên cứu sử dụng thiết bị khuấy đảo liên tục khi xử lý tách tạp chất phi Collagen cũng như tách chiết Collagen ở các công đoạn tiếp theo, nhằm nâng cao hiệu quả thu nhận Collagen.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt:
1. Bộ thủy sản, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II (2002), Tuyển tập nghề cá
sông Cửu Long, NXB Nông nghiệp.
2. Nguyễn Trọng Cẩn, Đỗ Minh Phụng (1996), Công Nghệ Chế Biến Thực Phẩm
Thủy Sản, tập I Nguyên liệu chế biến thủy sản. Nhà xuất bản Nông Nghiệp TP. Hồ Chí Minh.
3. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (1992), Hóa sinh học, Nhà xuất bản Trường Đại học Sư phạm.
4. Nguyễn Thị Lệ Diệu (2001), Tìm hiểu về cá Tra (Pangasitus hypophthalmus) và sản xuất thử một số sản phẩm từ loài cá này, Luận văn thạc sỹ kỹ thuật, Tp. Hồ Chí Minh.
5. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn (2004), Sản xuất các chế
phẩm kỹ thuật và y dược từ phế liệu thủy sản, Nxb Nông nghiệp.
6. Trần Thị Luyến (2001), Những phản ứng cơ bản và các biến đổi của thực phẩm
trong quá trình chế biến và bảo quản, Trường Đại học Thủy sản, Nha Trang.
7. Đỗ Minh Phụng, Đặng Văn Hợp (1997), Phân tích kiểm nghiệm sản phẩm thủy
sản, Đại học Thủy sản, Nha Trang.
8. Lê Ngọc Tú, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Ngô Hữu Hợp, Đặng Thị Thu, Nguyễn Trọng Cẩn (2003), Hóa học thực phẩm, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội.
9. Lê Ngọc Tú (Chủ biên), La Ăn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Lê Doãn Biên,(2000), Hóa sinh học công
nghiệp, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
10.Đỗ Thị Thanh Thu (2001), Hóa sinh ứng dụng, Nxb Đại học Quốc gia, Tp Hồ Chí Minh.
Tài liệu Tiếng Anh:
11.Bryan Jeun, Hyukjin Lee, Saurabh Aggarwal, Hailin Wang, Qiang Li, Sukyeon Hwang (2002), Application of Collagen in Drug Delivery, Topics in Biomaterial
12.Bryan Jeun, Hyukjin Lee, Saurabh Aggarwal, Hailin Wang, Qiang Li, Sukyeon Hwang (2002), Application of Collagen in Drug Delivery, Topics in Biomaterial 13.E.J. Miller, Chemistry of collagens and their distribution, in: K.A.Piez, A.H. Reddi (Eds.), Extracellular Matrix Biochemistry, Elsevier, New York, 1984, pp. 41– 82 .Z. Deyl, M. Adam, Chromatogr. 488 (1989), page 161
14.K. A. Nam, S. G. You, and S. M.Kim (2007), Physicochemical properties of squid skin collagen, proceedings of the 11th international symposium on the efficient application and preservation of marine biological resources, Nha Trang university, pages 72-89
15.K. A. Nam, S. G. You, and S. M.Kim (2007), Physicochemical properties of squid skin collagen, proceedings of the 11th international symposium on the efficient application and preservation of marine biological resources, Nha Trang university, pages 72-89
16.LS. Sensrsture, Pyo-JamPark, Se-Kwon Kim (2006), Isolation and characterization of collagen from brown backed toadfish skin, Bioresource technology, pages 191-197
17.Maria Sadowska, Ilona Kolodziejska, Celina Niecikowska (2003), Isolation of collagen from the skin of Baltic cod (Gadus morhua), Food chemistry, pages 257-262 18. Min Zhang, Wentao, Guoying Li (2009), Isolation and characterisation of collagen from the skin of largefin longbarbel catfish (Mystus macropterus), Food chemistry, pages 826-831.
19.Takeshi Nagai, Masami Izumi, Masahide Ishii (2004), Fish scale collagen- preparation and partial characterization, International Journal of Food Science and Technology, pages 239-244
20.Vittayanont, Bebjakul, The extracting collagen from chicken feet
Tài liệu Web
21.http://www.ttvn.com.vn 22.http://www.articlesbase.com
23.http://www.clfish.com/inc/pdf/nghean_gov_vn.pdf
25.http://www.sonnptnt.dongthap.gov.vn 26.http://www.vietfish.com.vn 27.http://www.tiengiang.gov.vn 28.http://www.vmedicalspa.com 29.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/ 30.http://archimede.bibl.ulaval.ca/archimede/files 31.http:// www.best care.vn 32.http://www.vmedicalspa.com 33.http://nationalrenderers.org/assets/essential_rendering_book_vietnamese.pdf 34.http://vienthuysan2.com
PHỤ LỤC
1. Các phương pháp phân tích định lượng
1.1. Xác định hàm lượng tro toàn phần: phương pháp nung mẫu ở nhiệt độ 500-
6000C, theo tiêu chuẩn TCVN 5105-90. [7]
Nguyên lý:
Dùng sức nóng (550-6000 C) nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ. Phần còn lại đem cân và tính ra hàm lượng tro toàn phần trong thực phẩm.
Dụng cụ, vật liệu và thuốc thử:
Chén nung bằng sứ hoặc bằng kim loại (bạch kim). Đèn cồn hay bếp điện.
Lò nung điều chỉnh được nhiệt độ (đến 550-6000C). Cân phân tích.
Bình hút ẩm, phía dưới để chất hút ẩm. H2O2 10 thể tích hoặc HNO3 đậm đặc.
Tiến hành:
Nung chén sứ hoặc chén kim loại đã rửa sạch ở lò nung tới 550-6000C đến trọng lượng không đổi. Để nguội ở bình hút ẩm và cân ở cân phân tích chính xác đến 10-4g.
Cho vào chén khoảng 5g chất thử. Cân tất cả ở cân phân tích, với độ chính xác như trên. Cho tất cả vào lò nung và tăng nhiệt độ từ từ cho đến 550-6000C. Nung cho đến tro trắng, nghĩa là đã loại hết các chất hữu cơ thông thường khoảng 6-7 giờ. Trường hợp còn tro đen, lấy ra để nguội, cho thêm vài giọt H2O2 10 thể tích hoặc HNO3 đậm đặc và nung lại cho đến tro trắng. Để nguội trong bình hút ẩm và cân ở cân có độ chính xác như trên. Tiếp tục nung thêm ở nhiệt độ trên trong 30 phút rồi để nguội trong bình hút ẩm và cân, lặp đi lặp lại thao tác này cho tới trọng lượng không đổi. Kết quả giữa hai lần nung và cân liên tiếp không được cách nhau quá 0,0005g.
Tính kết quả:
X1= 2 1 .100% G G G G Trong đó:
G1: khối lượng chén nung và mẫu (g) G: khối lượng chén nung (g)
G2: khối lượng chén nung và tro trắng (g)
Chú thích:
Trường hợp thực phẩm dễ bốc cháy như đường, mỡ,… đốt trên đèn cồn hay bếp điện cho đến khi thành than đen không bốc cháy nữa mới cho vào lò nung. Nếu thực phẩm lỏng, cô khô trên ngọn lửa trước khi nung.
Khi chén nung còn nóng để vào bình hút ẩm, nhớ để nắp hé mở lúc đầu hoặc mở vòi không khí trên nắp bình hút ẩm tránh không khí nóng nở ra đẩy bật làm vỡ nắp bình.
1.2. Phương pháp xác định hàm lượng protein tổng số: phương pháp Kjeldahl theo tiêu chuẩn TCVN 4295-86 (thông qua phương pháp xác định nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl ). [7]
Nguyên lý:
Để xác định đạm tổng quát trong thực phẩm người ta dùng H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác đặc biệt là hỗn hợp CuSO4 và K2SO4 theo tỉ lệ 1/10 để vô cơ hóa; mục đích để chuyển toàn bộ nitơ trong thực phẩm về dạng muối (NH4)2SO4. Sau đó dùng NaOH đặc để đẩy NH3 ra và dùng hơi nước lôi cuốn NH3 ra khỏi thiết bị chưng cất vào cốc hứng chứa H2SO4 0,1N dư, cuối cùng dùng NaOH 0,1N chuẩn độ lại H2SO4dư.
Dụng cụ, vật liệu và thuốc thử
Dụng cụ vật liệu thông thường của phòng thí nghiệm. Bình Kjeldahl.
H2SO4 đậm đặc (D= 1,84).
Các chất xúc tác có thể sử dụng một trong các hỗn hợp xúc tác dưới đây: K2SO4: 50g.
CuSO4: 3,5g. K2SO4 : 100g. CuSO4: 10g. Selenium bột : 1g. K2SO4: 100g. CuSO4: 10g. HgO: 10g.
Hai loại xúc tác 2 và 3 vô cơ rất nhanh nhưng loại xúc tác thứ 3 bay hơi Hg rất độc.
NaOH 50% (D=1,33) (không chứa carbonate).
Chỉ thị màu: methyl đỏ 0,1g và cồn 950 vừa đủ 100ml. Dung dịch chuẩn H2SO4 0,1N hoặc HCl 0,1N.
Cách tiến hành:
Lấy chính xác 1g mẫu cho cẩn thận vào bình Kjeldahl, thêm 2g hỗn hợp chất xúc tác (CuSO4/K2SO4) và 10 ml H2SO4 đậm đặc để nghiêng trên bếp đun từ từ. Trong quá trình vô cơ hóa màu sắc của mẫu chuyển từ màu nâu đen sang màu vàng rồi xanh trong hoặc không màu là được.
Sau khi đã chuẩn bị mẫu xong chuyển qua sử dụng máy bán tự động thay cho thiết bị chưng cất. Định lượng trực tiếp NH3 bay ra bằng H2SO4 0,1N dư có trong cốc hứng, sau đó dùng NaOH 0,1N chuẩn độ lại lượng H2SO4 0,1N dư trong cốc hứng cho đến khi dung dịch chuyến từ màu đỏ sang màu vàng nhạt là được.
Tính kết quả:
Hàm lượng đạm toàn phần theo công thức sau:
Trong đó: 0,0014. (A-B).100 Ntp= (%) (mẫu rắn) P 0,0014. f . (A-B) . 1000 Ntp= (gN/lit) (mẫu lỏng) V
A: là số ml H2SO4 0,1N dùng trong cốc hứng. B: là số ml NaOH 0,1N dùng trong chuẩn độ. P: là khối lượng mẫu thử (mẫu rắn), (g). V: là thể tích mẫu thử (mẫu lỏng), (ml).
0,0014: là số g nitơ tương ứng với 1ml H2SO4 0,1N. f: là hệ số pha loãng.
1000: là hệ số chuyển đổi từ ml sang lit. Hàm lượng protein = Ntp . 6,25
1.3. Xác định hàm lượng lipid
Định lượng chất béo tổng số bằng phương pháp folch
Nguyên tắc: Dùng hỗn hợp dung môi Chloroform và Methanol với tỷ lệ 2:1 để hòa tan tất cả các chất béo trong thực phẩm, tách lớp và chiết qua phễu lọc nhiều lần. Sau khi làm bay hơi hết dung môi, cân chất béo còn lại và tính ra hàm lượng lipid trong 100g thực phẩm.
Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất:
Dụng cụ và thiết bị:
Tủ hút, máy đồng hóa, máy cô quay chân không, tủ sấy chân không, bộ thổi khí N2. Phễu chiết 250ml và 100ml, bình cầu 100ml, bình định mức 5ml, ống nghiệm có nắp 5, ống thủy tinh Vial cao 20ml, ống thủy tinh có nắp 4ml, ống xilanh 20ml, giấy lọc GF/C, giá đỡ dụng cụ chiết, pipette pasture.
Hóa chất:
BHT (Butylated hydroxyl toluene), pha 20ml BHT trong 1ml Chloroform. Methanol MeOH 50% (MeOH:H2O, tỷ lệ 1:1), pha 50ml Methanol với 50ml nước cất vừa đủ bình định mức 100ml khuấy đều.
Chloroform
NaCl 0,9%, cân 9g muối tinh thể cho vào bình định mức 1 lít, thêm nước cất vào khuấy tan và định mức đến vạch định mức.
Kiểm tra dụng cụ và thiết bị như: kiểm tra bộ tách chiết, bình khí nitơ. Tiến hành thử nghiệm:
Tách lipid từ mẫu:
Cân 1g mẫu đã được băm nhuyễn và trộn đều, cho vào ống thủy tinh vial cao thể tích 20ml. Cho thêm 600 µl nước cất, 5ml Methanol, 10ml Chloroform và 200µl BHT, ngâm mẫu trong dung môi khoảng 10 phút. Đồng hóa mẫu bằng máy trong 1 phút. Đổ vào ống xilanh có lót tấm giấy lọc GF/C ở dưới đáy cho dịch mẫu chảy xuống hết hoàn toàn. Cho thêm 5ml Methanol và 10ml Chloroform vào vial và đồng hóa mẫu trong 20 giây. Đổ dung dịch này vào xilanh, cho mẫu được lọc hết hoàn toàn.
Sử dụng piton xilanh để ép tống dung dịch còn lại trong xilanh xuống phễu chiết 100ml. Cho thêm 7,5ml NaCl 0,9% vào phiễu chiết chứa dịch mẫu, đảo trộn ngược phễu chiết nhiều lần và giữ mẫu ở 50C trong khoảng 4h để dịch mẫu phân chia thành 2 lớp.
Chiết rút dung dịch lipid:
Tách lớp dưới (chứa hàm lượng lipid hòa tan trong dung môi) cho chảy qua phiễu chiết có thể tích 50ml, loại bỏ lớp dịch phía trên (chứa phần hỗn hợp gồm các tạp chất được loại như nước, protein, muối…).
Xác định thể tích chiết ở trên (V): X=1/4 V (ml)
Cho thêm 5ml MeOH 50% vào mỗi mẫu trong phiễu chiết 100ml, đảo trộn ngược phễu chiết nhiều lần.
Cho phân chia tách thành 2 lớp và lắng qua đêm ở 50C.
Định lượng lipid:
Lớp dưới được rút chảy xuống bình cầu 100ml. Cô quay chân không làm bay hơi dung môi trong bình cầu ở 370C đến khi còn lại thể tích khoảng 1ml. Hòa tan mẫu lại ngay lập tức bằng một lượng thể tích nhỏ Chloroform (chỉ cho phép tiếp xúc rất nhỏ lượng mẫu đã làm khô với không khí). Chuyển lượng mẫu qua bình định mức 5ml, tráng rửa bình cầu nhiều lần và định mức bằng Chloroform vừa đủ 5ml. Sau khi xử lý xong, dung dịch này được mang đi xác định hàm lượng lipid tổng. Dung dịch này có thể lưu giữ trong tủ đông -200C.
Lấy chính xác 2ml dung dịch mẫu đã xử lý, cho vào một ống thủy tinh có nắp 4ml đã được sấy chân không đến khối lượng không đổi, áp suất khoảng 65-70 psi trong 1h.
Lipid tổng số (%) tính theo công thức:
% Xt (g/g) = 1 0. .100 . dm m m m V m V % Xk (g/g) = 1 0. .100 . . dm m m m V m T V Trong đó:
Xt: Hàm lượng lipid tổng số tính theo trọng lượng tươi của mẫu. Xk: Hàm lượng lipid tổng số tính theo trọng lượng khô của mẫu. M1: Trọng lượng cân ống vial và mẫu sau khi sấy (g).
M0: Trọng lượng cân ống vial khối lượng không đổi (g). M: Trọng lượng cân mẫu (g).
Vdm: Thể tích định mức sau xử lý (ml).
Vm: Thể tích mẫu sau xử lý lấy để sấy mẫu (ml). T: Thành phần khô của mẫu, T=(100 - W)/100. W: Độ ẩm của mẫu (%). Lập bảng kết quả: %Lipit STT Tên mẫu Tươi Khô Nhận xét 1 2 3 , , ,
1.4. Phương pháp xác định hàm lượng nước (hàm ẩm) của da cá
Dùng phương pháp sấy ở nhiệt độ cao.
Nguyên lý:
Dùng nhiệt độ cao để làm bay hơi hết nước trong mẫu thử, sau đó dựa vào hiệu số khối lượng của mẫu thử trước và sau khi sấy sẽ tính được hàm lượng nước trong thực phẩm.
Cách thực hiện:
Sấy cốc đến khối lượng không đổi: cốc được rửa sạch, úp khô, sấy ở nhiệt độ 100-1050C trong khoảng 2h, lấy ra để trong bình hút ẩm sau đó cân và sấy tiếp ở nhiệt độ như trên cho đến khi giữa 2 lần cân liên tiếp sai khác không quá 5.10-3 g.
Cân chính xác khoảng 2-4g mẫu (đã được chuẩn bị) trong cốc đã sấy khô đến khối lượng không đổi, dàn đều mẫu trên đáy cốc, chuyển cốc vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 60-800C trong vòng 2h, sau đó nâng nhiệt độ lên 100-1050C, sấy liên tục trong vòng 3h.
Lấy mẫu ra để trong bình hút ẩm và cân trên cân phân tích sau đó sấy tiếp cho đến khi có khối lượng không đổi như trên.
Tính kết quả:
Độ ẩm được tính theo công thức sau:
X(H2O) = .100(%)
Trong đó: G1: khối lượng cốc sấy và mẫu (g).
G2: khối lượng cốc sấy và mẫu sau sấy (g). XH2O: độ ẩm (hàm lượng nước) của mẫu (%).
1 2 1 G G G G