CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nhân giống in vitro cây Xáo tam phân
2.4.1. Phương pháp tạo vật liệu khởi đầu nhân giống in vitro Xáo tam phân
Phương pháp tạo vật liệu khởi đầu từ đoạn thân: Các đoạn thân có kích thước 40 cm (tính từ ngọn) được thu để vào mẫu. Cành Xáo tam phân được rửa sạch dưới vòi nước chảy mạnh, rửa bằng xà phòng 10 phút, tráng lại 3 - 4 lần bằng nước cất vô trùng và đưa vào tủ cấy vô trùng. Sau đó, mẫu cành được cắt thành nhiều đoạn nhỏ, mỗi đoạn chứa ít nhất từ 1 đến 2 mắt đốt và được khử trùng bằng nano bạc và dung dịch Johnson 2,5% với nồng độ và khoảng thời gian khác nhau để tạo mẫu sạch từ đoạn thân.
Phương pháp tạo vật liệu khởi đầu từ hạt Xáo tam phân: Quả Xáo tam phân sau thu hái, rửa sạch bằng xà phòng trong 10 phút, tráng lại 2 - 3 lần bằng nước cất, tráng lại trong cồn 30 giây và đưa vào tủ cấy vô trùng. Tại đây, quả Xáo tam phân được khử trùng bằng nano bạc, Johnson 2,5% trong các khoảng thời gian khác nhau, khi quả sạch tiến hành tách vỏ lấy hạt, hạt sau khi tách được lắc trong dung dịch Johnson 1% trong 3 phút, tráng lại 1- 2 lần bằng nước cất vô trùng và cấy vào môi trường MS để tạo mẫu sạch từ quả.
Chỉ tiêu theo dõi:
1. Tỉ lệ mẫu sống, sạch bệnh =
2. Tỉ lệ mẫu nhiễm =
3. Tỉ lệ mẫu chết =
Σ Số mẫu nuôi cấy Kết quả theo dõi: Sau 2 tuần.
2.4.2. Ảnh hưởng của nền môi trường tới khả năng sinh trưởng Xáo tam phân trong điều kiện in vitro
Ba loại môi trường cơ bản MS (Murashuge-Skoog, 1962) [73], WPM (Lloyd and McCown, 1981) [96] và Knudson (Knudson L., 1946) [97] được sử dụng nhằm tìm ra nền môi trường phù hợp nhất cho sự sinh trưởng và nhân nhanh P. trimera.
pH môi trường 5,6. Tất cả các thí nghiệm được bổ sung 7 g/l agar, hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút. Kết quả thí nghiệm được đánh giá sau 4 tuần.
Chỉ tiêu theo dõi:
Tỷ lệ mẫu phát sinh chồi (%) =
Kết quả theo dõi: Sau 4 tuần.
2.4.3. Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo Xáo tam phân
Nguồn mẫu sử dụng tạo mô sẹo là lá mầm từ hạt Xáo tam phân sau khử trùng. Các lá mầm sau khử trùng được cắt nhỏ và cấy vào môi trường có bổ sung auxin (IAA, IBA, 2.4D và TDZ) với các nồng độ khác nhau (từ 0,1 - 3,0 mg/l), sucrose (20 g/l), pH 5.8, 7 g/l agar, hấp khử trùng ở 121 °C trong 20 phút. Kết quả thí nghiệm được đánh giá sau 12 tuần.
Chỉ tiêu theo dõi:
Tỷ lệ mẫu phát sinh mô sẹo (%) =
2.4.4. Ảnh hưởng của nhóm cytokinins và auxin tới khả năng nhân nhanh Xáo tam phân
Các nguồn vật liệu (đoạn thân, hạt và mô sẹo) được sử dụng cho nghiên cứu phát sinh chồi. Nghiên cứu nhân nhanh Xáo tam phân được thực hiện trong môi trường nền thích hợp nhất ở thí nghiệm 2.4.2 có bổ sung cytokinin như BA (1,0 - 5,0 mg/l), TDZ (0 - 0,5 mg/l) và phối hợp giữa hai loại phytohormon là cytokinins và auxin với các nồng độ khác nhau (từ 0,1 - 3,0 mg/l), sucrose (20 g/l), pH 5.8, 7 g/l agar, hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút.
Chỉ tiêu theo dõi :
Σ Số chồi 1. Số chồi/mẫu =
Σ Số đoạn thân tạo chồi
Σ Số đoạn thân tạo chồi 2. Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) =
Σ Số đoạn thân theo dõi Kết quả: Theo dõi sau 8 tuần
2.4.5. Ảnh hưởng của nhóm auxin tới khả năng hình thành rễ Xáo tam phân Nghiên cứu tạo rễ Xáo tam phân được thực hiện trong môi trường nền thích hợp nhất ở thí nghiệm 2.4.2 bổ sung auxin (IBA, α-NAA) với các nồng độ khác nhau (từ 0,1 - 3,0 mg/l), sucrose (20 g/l), pH 5.8, 7 g/l agar, hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút. Các chồi Xáo tam phân có kích thước từ 2 - 3 cm được tách ra và cấy vào môi trường phát sinh rễ. Kết quả thí nghiệm được đánh giá sau 8 tuần.
Chỉ tiêu theo dõi :
1. Số rễ/mẫu =
2. Tỷ lệ mẫu tạo rễ =
2.4.6. Phương pháp bố trí và xử lý thí nghiệm
Các thí nghiệm nhân giống Xáo tam phân được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, ba lần lặp lại, mỗi lần 10 mẫu. Các mẫu được nuôi cấy trong bình thuỷ tinh 250 ml. Số liệu được thu thập hàng tuần bao gồm tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu phát sinh mô sẹo, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi, tỷ lệ mẫu tạo rễ. Đặc điểm chồi, số lượng chồi, chất lượng chồi, đặc điểm rễ, chất lượng rễ và chất lượng mô sẹo được ghi nhận.
Kết quả phân tích được hiển thị bằng giá trị trung bình và sai số (độ lệch chuẩn). Sự khác biệt giữa các công thức thí nghiệm được xác định dựa vào phân tích One way ANOVA. Sự khác biệt giữa các cặp giá trị trung bình được phân tích hậu kiểm bằng Tukey’s test.