CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.5. Xây dựng chỉ thị DNA để nhận dạng Xáo tam phân P. trimera
3.5.4. Xây dựng cây tiến hóa giữa các loài
Để xác định quan hệ tiến hóa giữa các trình tự trình tự ITS, matK hoặc rbcL thuộc các loài thuộc chi Paramignya nhằm đánh giá khả năng phân biệt giữa các loài, phương pháp phân tích ký tự (character based method) dựa vào 2 chương trình MegaX (sử dụng thuật toán Maximum likelihood (ML) với mô hình tiến hóa K2P và chương trình BEAST (sử dụng thuật toán Bayesian inference (BI) và mô hình Prior Coalescant Bayesian Skyline).
Thuật toán ML xây dựng cây tiến hóa dựa vào đưa ra khả năng cao nhất theo dạng điểm và đưa ra giá trị tối đa trong số các khả năng, trong khi đó thuật toán của Bayesian inference lại tính toán tất cả các khả năng theo dạng phân bố và trả về kết quả xác suất dạng mật độ thay vì điểm so với thuật toán ML. Sự khác nhau chính của 2 thuật toán này là đối với ML sử dụng kiểm định thống kê bằng giá trị bootstrap, trong khi đó BI sử dụng “posterior probabilities” hay xác suất một sự kiện xảy ra sau khi tính toán tất cả các thông tin có thể. Việc kết hợp giữa 2 phương pháp xây dựng cây tiến hóa này nhằm tăng độ tin cậy và loại bỏ các khả năng xảy ra
ngẫu nhiên của các cây tiến hóa dựa vào vùng trình tự đã lựa chọn. Kết quả xây dựng các cây tiến hóa tương ứng đối với các trình tự ITS, matK và rbcL được trình bày và thảo luận chi tiết ở các phần dưới đây.
3.5.4.1. Xây dựng cây tiến hóa từ trình tự ITS
Cây tiến hóa được xây dựng từ trình tự ITS bằng thuật toán ML cho thấy có sự đan xen giữa các mẫu trong chi Paramignya. Trong đó, các trình tự thuộc nhóm P.
trimera X1, X3 nằm cùng 1 nhánh với loài P. trimera có số truy cập KM111544.1 thu thập ở Vĩnh Phương, Khánh Hòa của nhóm nghiên cứu Thien, V.H., Khanh, N.D. và Nam,T.N đã công bố vào năm 2014. Các mẫu còn lại P. trimera X2, X4 và X5 mặc dù nằm trong cùng 1 nhánh nhưng có mối quan hệ rất gần với 2 loài P. monophylla, P.
rectispinosa và P. scandens. Nhánh này chia sẻ tổ tiên chung với loài P. confertifolia (HG004846.1) có nguồn gốc từ Yunna Mensong, Trung Quốc (Hình 3.21a).
Hình 3.21a. Mối quan hệ tiến hóa giữa các loài thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự ITS sử dụng thuật toán ML của chương trình MegaX Ghi chú: Cây tiến hóađược xây dựng bằng chương trình MegaX với thuật toán Maximum likelihood (ML) sử dụng mô hình tiến hóa Kimura two-parameter (K2P) (Kimura 1980)
Đối với chương trình BEAST sử dụng thuật toán thống kê Bayesian inference cho thấy, vẫn có sự đan xen giữa các mẫu trong chi Paramignya. Trong đó, các trình tự của các mẫu nhóm P. trimera X3, X4 và X5 nằm cùng 1 nhánh riêng, các trình tự của các mẫu trong nhóm P. trimera X1 và X2 nằm chung trong
cùng 1 nhóm với P. monophylla và P. confertifolia (HG004846.1) có nguồn gốc ở Yunnan, Mensong, Trung Quốc, trong khi 1 nhánh riêng gồm 3 loài P. rectispinosa, P. armata, P. scandens và P. trimera (KM111544.1) có nguồn gốc ở Vĩnh Phương, Khánh Hòa (Hình 3.21b).
Hình 3.21b. Mối quan hệ tiến hóa giữa các loài thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự ITS sử dụng chương trình BEAST
Ghi chú: Cây tiến hóađược xây dựng bằng chương trình BEAST sử dụng thuật toán thống
kê Bayesian inference với mô hình (Clock Model: Strict); Priors: Coalescent extended Bayesian Skyline với các thông số chi tiết mô tả trong phần phương pháp nghiên cứu.
Như vậy, đối với trình tự ITS khi sử dụng cả 2 chương trình MegaX và BEAST vẫn thể hiện sự đan xen giữa các mẫu P. trimera với các loài khác thuộc chi Paramignya. Điều này cho thấy, khả năng sử dụng trình tự ITS làm chỉ thị để nhận dạng loài Xáo tam phân P. trimera vẫn có nguy cơ bị nhầm lẫn với một số loài gần gũi thuộc chi này, chẳng hạn như P. monophylla hoặc P. confertifolia.
3.5.4.2. Xây dựng cây tiến hóa từ trình tự matK
Kết quả xây dựng cây tiến hóa từ trình tự matK bằng thuật toán ML cho thấy có sự tách biệt rõ ràng giữa các mẫu P. trimera với các loài khác thuộc chi Paramignya. Trong đó, các trình tự thuộc nhóm P. trimera X1 - X5 nằm trong cùng
1 nhóm (monophyletic group). Các loài với loài P. monophylla, P. rectispinosa, P.
scandens và P. armata nằm trong cùng 1 nhóm (polyphyletic group) chia thành 2 nhánh nhỏ (clade). Hai loài P. confertifolia (HG004970.1) có nguồn gốc ở Yunna Mengsong, Trung Quốc và P. scandens (EF138912.1) có nguồn gốc từ Australia nằm trong cùng 1 nhóm (Hình 3.22a).
Hình 3.22a. Mối quan hệ tiến hóa giữa các loài thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự matK sử dụng thuật toán ML của chương trình MegaX Ghi chú: Cây tiến hóađược xây dựng bằng chương trình MegaX với thuật toán Maximum
likelihood (ML) sử dụng mô hình tiến hóa Kimura two-parameter (K2P)[63]
Đối với chương trình BEAST sử dụng thuật toán thống kê Bayesian inference cho thấy các trình tự của các mẫu nhóm P. trimera X1 - X5 nhóm thành 1 nhóm lớn (polyphyletic group) tách riêng khỏi các loài còn lại thuộc chi Paramignya. Trong nhóm lớn này, các mẫu P. trimera X1 - X4 nằm trong một nhóm riêng (monophyletic group), mẫu P. trimera X5 tách riêng thành một nhánh nhưng cùng chia sẻ tổ tiên chung. Các loài P. monophylla, P. rectispinosa, P. scandens và P. armata cùng với P. confertifolia (HG004970.1) có nguồn gốc từ Yunnan, Mengsong, Trung Quốc) nằm trong 1 nhóm lớn (polyphyletic group). Riêng loài P.
scandens có nguồn gốc từ Australia tách riêng thành 1 nhóm ngoại (out group) (Hình 3.22b).
Hình 3.22b. Mối quan hệ tiến hóa giữa các loài thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự matK sử dụng chương trình BEAST
Ghi chú: Cây tiến hóa được xây dựng bằng chương trình BEAST sử dụng thuật toán thống kê Bayesian inference với mô hình (Clock Model: Strict); Priors: Coalescent extended
Bayesian Skyline với các thông số chi tiết mô tả trong phần phương pháp nghiên cứu.
Như vậy, đối với trình tự matK khi sử dụng cả 2 chương trình MegaX và BEAST cho kết quả tương tự nhau, trong đó các loài P. trimera nằm trong cùng 1 nhóm tách biệt khỏi các loài còn lại trong chi Paramignya. Kết quả nghiên cứu cho thấy, trình tự matK có thể sử dụng làm chỉ thị để nhận dạng loài Xáo tam phân P.
trimera với các loài khác trong chi Paramignya.
3.5.4.3. Xây dựng cây tiến hóa bằng trình tự rbcL
Tương tự, kết quả xây dựng cây tiến hóa từ trình tự rbcL bằng thuật toán ML cho thấy có sự đan xen giữa các mẫu P. trimera X1, X2, X3 và X4 với các mẫu P.
monophylla, P. armata và P. trimera X5 có cùng một nhánh nhưng chia sẻ cùng tổ tiên chung với P. scandens. Các loài P. rectispinosa và P. confertifolia (KF18542.1) ở Yunna Mensong, Trung Quốc đã tách riêng thành 2 nhánh trong 1 cụm (polyphyletic group). Riêng 4 loài Severinia buxifolia (AB505912.1) ở Nhật Bản và 3 loài P. monophylla (AF320881.1), P. scandens (EF126562.1) và P. lobata
(EF126561.1) ở Australia phân bố trong 1 nhánh lớn (polyphyletic group). Rõ ràng
Severinia buxifolia (AB505912.1) ở Nhật Bản là một loài thuộc chi Severinia nên đã tách riêng rẽ thành một nhánh. Điều này cũng phù hợp với vị trí phân loại của chi này trong họ Rutaceae (Hình 3.23a).
Hình 3.23a. Mối quan hệ tiến hóa giữa các loài thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự rbcL sử dụng chương trình MegaX
Ghi chú: Cây tiến hóa được xây dựng bằng chương trình MegaX với thuật toán Maximum likelihood (ML) sử dụng mô hình tiến hóa Kimura two-parameter (K2P) (Kimura 1980). Severinia buxifolia (Japan)(*) là loài có hình thái rất giống với P. armata nên được đưa vào phân tích.
Đối với chương trình BEAST sử dụng thuật toán thống kê Bayesian inference (Hình 2.23b) cho thấy các trình tự của các mẫu nhóm P. trimera X1, X3, X5 phân bố trong cùng 1 nhánh với P. scandens và P. monophylla (AF320881.1) có nguồn gốc ở Australia. Hai mẫu P. trimera X2 và X4 nằm trong 1 nhánh lớn (polyphyletic group) gồm 9 loài, trong đó 1 nhánh (monophyletic group) gồm 2 loài Severinia buxifolia (AB505912.1) có nguồn gốc từ Nhật Bản và P. monophyla, 1 nhánh (monophyletic group) gồm 2 loài P. armata và P. rectispinosa, một nhánh (polyphyletic group) gồm 4 loài gồm P. trimera X2, X4 với 3 loài P. lobata (EF126561.1) và P. scandens (EF126562.1) có nguồn gốc từ Australia và P.
confertifolia (KF182542.1) từ Yunnan, Mensong, Trung Quốc (Hình 3.23b).
Hình 3.23b. Mối quan hệ tiến hóa giữa các loài thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự rbcL sử dụng chương
trình BEAST
Ghi chú: Cây tiến hóa được xây dựng bằng chương trình BEAST sử dụng thuật toán thống kê
Bayesian inference với mô hình (Clock Model: Strict); Priors: Coalescent extended Bayesian Skyline với các thông số chi tiết mô tả trong phần phương pháp nghiên cứu. Severinia buxifolia
(Japan)(*) là loài có hình thái rất giống với P. armata nên được đưa vào phân tích.
Như vậy, đối với trình tự rbcL khi sử dụng cả 2 chương trình MegaX và BEAST đều cho thấy có sự đan xen giữa các mẫu P. trimera với các loài khác thuộc chi Paramignya. Điều này cho thấy, khả năng sử dụng trình tự rbcL làm chỉ thị để nhận dạng loài Xáo tam phân P. trimera vẫn có khả năng bị lẫn với một số loài gần gũi thuộc cùng chi như P. monophylla hoặc P. scandens.