CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.6. Nhân giống in vitro Xáo tam phân
3.6.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm cytokinins tới khả năng nhân nhanh Xáo tam phân
3.5.4.1. Ảnh hưởng của nhóm BA tới khả năng phát sinh chồi Xáo tam phân
Để nghiên cứu sự phát sinh chồi in vitro Xáo tam phân, ba nguồn vật liệu (đoạn thân bánh tẻ, hạt và mô sẹo in vitro) sạch bệnh được sử dụng cho nghiên cứu nhân nhanh in vitro. Trong nghiên cứu nhân nhanh, BA (1,0 - 5,0 mg/l) được sử dụng để đánh giá khả năng nhân nhanh, sinh trưởng và phát triển của các mẫu nghiên cứu (Bảng 3.13).
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của BA tới khả năng phát sinh chồi Xáo tam phân Đoạn thân Nồng
độ BA (mg/l)
0 1,0 2,0
3,0 4,0 5,0
Các chồi xuất hiện sau 3 - 4 tuần ở hầu hết các mẫu nghiên cứu. Ở mẫu hạt Xáo tam phân cho tỷ lệ mẫu phát sinh chồi đạt 100% khi sử dụng từ 3,0 mg/l BA trở lên. Ngược lại đối với vật liệu vào mẫu là mô sẹo, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi thấp, cao nhất chỉ đạt 3,06 ± 0,72 % và số chồi/mẫu đạt 0,20 ± 0,06 chồi/mẫu. Đối với vật liệu vào mẫu là đoạn thân mang chồi ngủ thì ở nồng độ BA (3,0 mg/l ) cho tỷ lệ mẫu phát sinh chồi cao đạt 66,67 ± 8,15 % và số chồi/mẫu đạt 3,17 ± 0,46 chồi/mẫu. Khi tăng nồng độ BA làm giảm tỷ lệ mẫu phát sinh chồi và chồi tạo ra mảnh, xốp và yếu
triển và nhân nhanh Xáo tam phân trong điều kiện in vitro (Bảng 3.13).
3.6.4.2. Ảnh hưởng của TDZ tới khả năng phát sinh chồi Xáo tam phân
Đoạn thân và hạt Xáo tam phân tiếp tục được nghiên cứu trong các thí nghiệm nhân nhanh tiếp theo. Các mẫu được cấy trong môi trường WPM bổ sung TDZ ở các nồng độ từ 0,1 đến 0,5 mg/l. Kết quả thu được thu thập sau 8 tuần nghiên cứu cho thấy, TDZ có tác động tích cực đến khả năng phát sinh chồi mẫu Xáo tam phân (Bảng 3.14).
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của TDZ tới sự phát sinh chồi Xáo tam phân
Nồng độ TDZ (mg/l)
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Sau 3 - 4 tuần, các chồi phụ bắt đầu phát sinh. Đối với mẫu hạt Xáo tam phân, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi đạt 71,36 ± 4,32% và số chồi/mẫu đạt 3,55 ± 0,46 chồi/mẫu (0,3 mg/l TDZ) cao hơn so với đoạn thân là 59,26 ± 7,08% và số chồi/mẫu đạt 2,3 ± 0,26 chồi/mẫu (0,2 mg/l TDZ). Khi nồng độ TDZ tăng lên, hiệu quả phát sinh chồi kém (Bảng 3.14). Kết quả nghiên cứu phù hợp với công bố của Guo B và cs., (2011). Đây cũng là lý do TDZ được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu phát sinh chồi và cơ quan ở hầu hết các loài thực vật hiện nay [82].
3.6.4.3. Ảnh hưởng của nhóm sự kết hợp giữa BA và TDZ tới khả năng phát sinh chồi Xáo tam phân
Để tối ưu tỷ lệ mẫu phát sinh chồi, hệ số nhân chồi và chất lượng chồi, nghiên cứu phối hợp giữa BA (1,0 - 5,0 mg/l) và TDZ (0,2 mg/l) được thực hiện.
Kết quả nghiên cứu sau 4 tuần (Bảng 3.15) cho thấy, đối với mẫu quả Xáo tam
chồi/mẫu cao nhất đạt 5,17 ± 0,46 chồi/mẫu.
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nhóm sự kết hợp giữa BA và TDZ tới khả năng phát sinh chồi Xáo tam phân
Nồng độ BA (mg/l)
0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0
Đối với đoạn thân, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi đạt 92,07 ± 7,27% và số lượng chồi/mẫu đạt 3,5 ± 0,48 chồi/mẫu. Ở nồng độ BA tăng từ 4,0 đến 5,0 mg/l cho hiệu quả phát sinh chồi kém, giảm từ 66,67 ± 7,94% đến 55,56 ± 7,49% Hiệu quả kết hợp giữa BA và TDZ cũng đã được đề cập trong nhiều bản thảo về nhân giống cây thân gỗ [101, 102]. Như vậy, trong nghiên cứu này, sử dụng kết hợp giữa BA (3,0 mg/l); TDZ (0,2 mg/l) là môi trường phù hợp nhất trong nhân giống Xáo tam phân in vitro (Bảng 3.15).
Hình 3.32. Ảnh hưởng của BA và TDZ tới khả năng phát sinh chồi từ đoạn thân Xáo tam phân sau 8 tuần nuôi cấy A (ĐC): 0; B: 1,0; C: 3,0; D: 2,0; E: 4,0; F: 5,0 (mg/l BA) và 0,2 mg/l TDZ
Hình 3.33. Ảnh hưởng của BA và TDZ tới khả năng phát sinh chồi từ hạt Xáo tam phân sau 4 tuần nuôi cấy
A (ĐC): 0; B: 1,0; C: 2,0; D: 3,0; E: 4,0; F: 5,0 (mg/l BA) và 0,2 mg/l TDZ 3.6.4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp nhóm cytokinin và auxin tới khả năng nhân nhanh chồi Xáo tam phân
a. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BA và α - NAA tới sự phát sinh chồi Xáo tam phân Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra kết quả nhân giống cao hơn khi phối hợp giữa hai loại phytohormon là cytokinin và auxin. Dựa trên kết quả nghiên cứu (Bảng 3.16) cho thấy nồng độ BA (3,0 mg/l) cho kết quả khả quan. Trong nghiên cứu này, nồng độ BA được giữ ở mức 3,0 mg/l và thay đổi nồng độ α-NAA (0 - 2,5 mg/l). Kết quả nghiên cứu sau 8 tuần được ghi nhận ở bảng 3.16.
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BA và α-NAA tới sự phát sinh chồi Xáo tam phân
α-NAA (mg/l)
0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Bổ sung TDZ có tác động đến hiệu quả phát sinh chồi, tăng số lượng và chất lượng chồi nuôi cấy. Tuy nhiên, trong thí nghiệm này, đối với mẫu đoạn thân, kết
lệ mẫu phát sinh chồi và số lượng chồi/mẫu đạt 72,96 ± 8,18% và 2,6 ± 0,38
chồi/mẫu. Với mẫu quả Xáo tam phân cho tỷ lệ mẫu phát sinh chồi 100%, và số chồi/mẫu đạt 4,33 ± 0,64 chồi/mẫu lớn hơn so với đối chứng là 3,55 ± 0,36 chồi/mẫu (Bảng 3.16).
Mặc dù, hiệu quả đặc trưng khi sử dụng phối hợp auxin và α - NAA được biết đến trong nhiều công bố nhưng trong nghiên cứu này, việc kết hợp giữa BA và α-NAA cho số lượng chồi/mẫu giảm đối với mẫu đoạn thân và tang nhẹ đối với mẫu quả, nhưng chất lượng chồi kém, nhanh bị rụng lá. Do vậy, α-NAA sẽ không được sử dụng cho các thí nghiệm nghiên cứu nhân nhanh in vitro Xáo tam phân tiếp theo.
b. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BA và IBA tới sự phát sinh chồi Xáo tam phân Để khảo sát khả năng tăng hệ số nhân chồi Xáo tam phân, nghiên cứu kết hợp giữa BA (3,0 mg/l) và IBA (0 - 1,25 mg/l) tiếp tục được tiến hành. Kết quả nghiên cứu sau 8 tuần cho thấy 100% mẫu phát sinh chồi với mẫu quả Xáo tam phân và số chồi/mẫu đạt 4,46 ± 0,66 chồi/mẫu ở công thức 3,0 mg/l BA và 0,75 mg/l IBA (Bảng 3.17).
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BA và IBA tới sự phát sinh chồi Xáo tam phân
IBA (mg/l)
0 0,25
0,5 0,75
1,0 1,25
Với vật liệu là đoạn thân cho tỷ lệ mẫu phát sinh chồi giảm từ 66,67 ± 7,01 % xuống 44,40 ± 5,38% khi môi trường BA có bổ sung thêm 0,25 mg/l IBA. Tuy nhiên khi tiếp tục tăng nồng độ IBA, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi tăng từ 44,40 ± 5,38% đến 77,78 ± 7,14 % ở môi trường bổ sung 1,0 mg/l IBA. Mặc dù hệ số nhân chồi có tăng so với đối chứng nhưng sự sinh trưởng của cây Xáo tam phân in vitro
kém hơn so với đối chứng, cành Xáo tam phân mảnh, yếu, lá nhanh rụng và có kích thước nhỏ (Hình 3.34).
A B C D E F
Hình 3.34. Ảnh hưởng của BA và IBA tới khả năng phát sinh chồi từ đoạn thân in vitro sau 8 tuần nuôi cấy
A (ĐC): 0; B: 0,25; C: 0,5; D: 0,75; E: 1,0; F: 1,25 (mg/l IBA) + (3,0 mg/l) BA 3.6.4.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA và α-NAA tới khả năng tạo rễ in vitro Xáo tam phân
Để khép kín quy trình nhân nhanh in vitro Xáo tam phân, các chồi nhỏ có kích thước từ 2 - 3 cm được chuyển sang môi trường WPM bổ sung α-NAA (0,5 - 2,0 mg/l) và IBA (0,5 - 2,5 mg/l). Kết quả nghiên cứu sau 12 tuần cho thấy IBA có khả năng kích thích tạo rễ tốt hơn so với α-NAA (Bảng 3.18). Tuy nhiên môi trường bổ sung α-NAA cần ít thời gian ra rễ hơn (8 tuần) so với IBA (10 tuần).
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của IBA và α-NAA tới khả năng hình thành rễ Xáo tam phân in vitro
Auxin (mg/l)
WPM (ĐC)
α-NAA
IBA
Sau 8 tuần, số lượng rễ/chồi và chiều dài rễ có sự khác biệt đáng kể giữa các công thức (Bảng 3.18, hình 3.35). Sau 12 tuần, rễ bắt đầu kéo dài và số lượng rễ đạt 2,31 ± 0,24 rễ/mẫu. Tỷ lệ mẫu phát sinh rễ đạt 92,71 ± 7,67% trong môi trường WPM có bổ sung thêm 1,5 mg/l IBA (Bảng 3.18).
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
mg/l IBA
Hình 3.35. Ảnh hưởng của IBA tới khả năng hình thành rễ Xáo tam phân in vitro sau 12 tuần nuôi cấy
3.6.4.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại giá thể tới khả năng sống của cây con in vitro
Các cây con in vitro sau khi có đủ rễ và lá sẽ được chuyển sang giá thể cát vàng, đất và trấu hun với các tỷ lệ khác nhau (Bảng 3.19). Kết quả nghiên cứu sau 2 tuần cho thấy, ở công thức 2 (cát vàng: đất theo tỷ lệ 1:1) cho tỷ lệ cây con in vitro sống cao nhất, tỷ lệ mẫu phát sinh rễ mới và số rễ trên mẫu đạt 68,68 ± 5,32 %, 88,06 ± 6,26 %, 2,31 ± 0,32 rễ/mẫu, tương ứng (Bảng 3.19).
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của một số loại giá thể tới khả năng sống của cây con in vitro
Giá thể
Cát vàng (100%) Cát vàng : đất (1:1) Cát vàng : Trấu hun (1:1)
Hình 3.36. Hình ảnh cây con in vitro Xáo tam phân sau ra ngôi 4 tuần trên giá thể đất : cát vàng
THẢO LUẬN: Sự phức tạp trong hệthống phân loại các loài thuộc chi Paramignya Theo CSDL các loài thực vật (www.theplantlist.org, 2020), hiện có khoảng 30 bản ghi (record) khi sử dụng từ khóa truy vấn Paramignya. Trong hệ thống BOLD có 10 mẫu đã công bố đại diện cho 4 loài thuộc chi Paramignya (P.
scandens, P. mindanaensis, P. lobata và P. confertifolia) trong đó có 6 trình tự mã vạch (DNA barcode) đã được mô tả và liên kết với cơ sở dữ liệu NCBI. Trước khi thực hiện nghiên cứu này, trong CSDL của NCBI chỉ có duy nhất 1 trình tự ITS của cây Xáo tam phân (Paramignya trimera) với số truy cập KM111544.1 (mẫu thu thập ở Vĩnh Phương, Khánh Hòa). Quá trình khảo sát, điều tra và thu thập các mẫu Xáo tam phân được triển khai ở các khu vực khác nhau thuộc tỉnh Khánh Hòa và Lâm Đồng vì đây là 2 khu vực có nhiều thông tin về sự phân bố chủ yếu của các loài Xáo thuộc chi Paramignya. Kết quả khảo sát đánh giá sự có mặt và mật độ phân bố tự nhiên của một số loài họ hàng gần gũi của Xáo tam phân ở trong tỉnh Khánh Hòa và Lâm Đồng đã được trình bày ở Bảng 2.1. và các Hình 3.4 - 3.9.
Thực tế khi khảo sát hình thái của Xáo tam phân phân bố ở Khánh Hòa và Lâm Đồng cho thấy, Xáo tam phân rất đa dạng về đặc điểm lá và thân (hình 3.5).
Ngay trong cùng ở địa điểm, hình thái của nhóm cá thể cũng khác nhau. Thậm chí, ngay trên cùng một cây đặc điểm thân lá cũng có nhiều khác biệt. Khi so sánh với một số loài phân bố trong các khu vực lân cận, có sự giống nhau về hình thái, chẳng
hạn như với một số loài thuộc chi Atalantia chẳng hạn như Atalantia buxifolia hoặc một số loài thuộc chi Lunvunga. Những yếu tố này đã gây ra khó khăn trong phân loại cũng như mức độ chắc chắn trong hệ thống phân loại loài. Các dạng khác nhau của lá Xáo tam phân được tìm thấy trong một số vùng khác nhau của tỉnh Khánh Hòa cho thấy có thể là do các dạng lai giữa P. trimera với các họ hàng gần như A.
buxifolia hoặc P. monophylla. Ngoài ra, sự kết hợp của các cơ chế di truyền như lai khác loài (outcross) để tạo ra các thể lai xa (interspecific hybrid), hiện tượng tự bất hợp (self-incompatibility), sinh sản vô tính (apomixis) và đột biến ngẫu nhiên trong quá trình phát triển phôi vô tính (somatic embryo) dẫn đến sự đa dạng về mặt hình thái của các loài thuộc chi Paramignya trong đó có Xáo tam phân (P.trimera).
Việc thiếu thông tin về các dạng mẫu chuẩn hay mẫu gốc (holotype) hoặc mẫu điển hình (lectotype) của P. trimera kết hợp với sự đa dạng hình thái dẫn đến khó khăn trong việc phân biệt các dạng khác nhau của P. trimera với các loài họ hàng trong chi Paramignya và các loài thuộc họ cam. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền thể hiện trong hình 3.10 cho thấy sự phức tạp trong các mối quan hệ giữa các loài thuộc chi Paramignya. Sự tồn tại của nhiều alen ở các locus khác nhau khi phân tích bằng các chỉ thị SSR cho thấy khả năng tồn tại các dạng lai có thể giữa P. trimera với các loài P. monophyla hoặc P. scandens, P. armata hoặc P.
rectispinosa.
Trong nghiên cứu này, một số loài họ hàng của P. trimera có đặc điểm hình thái tương tự với A. buxifolia, đặc biệt là lá và thân (Hình 3.6). Đây là lý do dẫn đến khó khăn trong việc nhận dạng rõ ràng các loài thuộc chi Paramignya. Tuy nhiên, dựa trên cả dữ liệu về hình thái và trình tự DNA, có thể phân biệt P. trimera với các loài khác thuộc chi Paramignya.
Trên thế giới, trong nhiều năm nghiên cứu về mặt phân loại, hầu hết các loài thuộc chi Paramignya đã được nhiều tác giả đã xếp vào chi Atalantia. P. trimera từng có các tên khác nhau như Triphasia monophylla DC hoặc Atalantia recvava Benth hoặc một số trường hợp xếp vào chi Luvunga. Theo Mabberley, Paramignya có quan hệ họ hàng gần với chi Luvunga nhất nên trong một thời gian P.
monophylla đã có tên khoa học là Luvunga monophylla (DC.). Tuy nhiên, trong các nghiên cứu sau này, một số loài thuộc chi Paramignya trong đó có P. trimera đã được tách ra khỏi chi Luvunga.
Về mặt hình thái, chi Luvunga Wight & Arn được coi là khác với Paramignya ở 3 - 5 nhị hoa, 6 - 10 nhị hoa và 2 - 4 vị trí trong noãn. Từ năm 1931, Burkill cũng đặt tên cho A. trimera là P. trimera do các loài Paramignya có quả nhỏ chứa dịch nhầy và không có túi cùi. Tuy nhiên, việc xác định nhầm các loài Paramignya đôi khi còn do đặc điểm của lá hoặc gai nách của chúng. Các lá đơn giản của một số loài thuộc chi Paramignya, kể cả P. trimera, đôi khi cũng xuất hiện trong chi Luvunga vì cuống lá của chúng ngắn hơn so với những lá có hình tam giác thông thường (Hình 3.8). Theo nghiên cứu về các mối quan hệ phát sinh loài trong họ phụ (sub-family) Aurantioideae dựa vào phân tích trình tự DNA lục lạp, trong bộ Citreae, gần như tất cả các loài đều phát triển gai nách, đơn lẻ hoặc ghép đôi, đôi khi uốn cong như ở Luvunga và Paramignya.