CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.3. Xác định đa dạng di truyền của các mẫu Xáo tam phân dựa vào chỉ thị SSR 81 3.4. Nghiên cứu chỉ thị DNA và nhận dạng loài
3.4.2. Nhận dạng loài dựa vào công cụ MEGABLAST
3.4.2.1. Nhận dạng loài dựa vào trình tự ITS của loài P. trimera X1
Theo quy trình cơ bản của hệ thống CBOL (Consortium for the Barcode of Life) bước đầu tiên trong việc nhận dạng loài là sử dụng công cụ Megablast để tìm các trình tự nucleotide tham chiếu có mức độ bắt cặp cao nhất trong GenBank.
Trong nghiên cứu này, kết quả Megablast vùng trình tự ITS có chiều dài 715 nucleotide (độ dài tương tự với các trình tự công bố trong GenBank) cho kết quả bắt cặp tốt nhất với 2 trình tự của loài P. trimera (KM111544.1) có nguồn gốc tại Vĩnh Phương, Khánh Hòa) và trình tự của loài P. confertifolia (HG004846.1) có nguồn gốc từ Yunnan, Mensong, Trung Quốc. Kết quả cho thấy các trình tự truy vấn ITS của các mẫu thuộc chi Paramignya đã bắt cặp ở mức độ giống nhau cao (similarity)
> 84,35%, độ che phủ (query coverage) từ 93 - 98% với các loài thuộc các chi P.
armata, P. trimera, Severinia buxifolia, P. confertifolia, Citrus trifolia, Citrus sinnesis, Citrus reticulata và dòng lai giữa Citrus và tangelo (Hình 3.15).
Hình 3.15. Kết quả Megablast sử dụng trình tự truy vấn ITS của P. trimera X1 Ghi chú: Các trình tự theo thứ tự từ 1 - 3 và từ 4 - 6 là trình tự ITS được đăng ký
trong GenBank của nghiên cứu này
Kết quả bắt cặp với trình tự của loài P. trimera có chiều dài 724 nucleotide với số truy cập là KM111544.1 của một nhóm tác giả Việt Nam tại Viện Công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm, thành phố Hồ Chí Minh vào năm 2014. Các thông số của kết quả Megablast với trình tự đích này bao gồm Max score và Total score (845), độ che phủ của trình tự truy vấn (95%), mức độ giống nhau/Per.Ident (89,18%). Như vậy, kết quả nghiên cứu này cũng đồng nhất với kết quả nghiên cứu trước đó và góp phần khẳng định được mức độ tin cậy của trình tự ITS của loài Xáo tam phân của Việt Nam. Các trình tự này có thể được sử dụng làm trình tự tham chiếu cho loài P. trimera.
Để xác định vị trí cũng như mối quan hệ với các trình tự tham chiếu có trong ngân hàng NCBI, kết quả phân tích bằng công cụ Blast tree view đã cho thấy vị trí và quan hệ về mặt phân loại của P. trimera và các loài có mối quan hệ gần gũi (Hình 3.16). Theo cây tiến hóa được tạo ra bởi công cụ Blast tree view, vị trí phân loại của các trình tự nghiên cứu thuộc chi Paramignya bao gồm cả P. trimera đã cụm thành một nhánh riêng độc lập cùng chia sẻ gốc với một nhánh độc lập gồm 1 loài P.confetifolia (Liana Mensong, China) với vai trò là một nhóm ngoại (outgroup).
Bên cạnh đó, một nhánh lớn tách riêng gồm các loài thuộc nhóm Citrus, Swingles và Pamburus. Như vậy, bằng cách sử dụng cặp mồi ITS trong nghiên cứu này để nhân vùng trình tự ITS và vùng trình tự này có khả năng làm chỉ thị phân tử để nhận dạng được chi Paramignya với các chi khác.
Hình 3.16. Cây quan hệ tiến hóa của P. trimera với các loài họ hàng
Ghi chú: Mối quan hệ tiến hóa thể hiện bằng mô hình cây được xây dựng bằng công cụ Blast tree view của NCBI sử dụng trình tự truy vấn ITS của P. trimera X1. Vị trí đánh dấu màu vàng trong hình thể hiện vị trí trong mối quan hệ của P.trimera với các loài có mối quan hệ gần gũi.
3.4.2.2. Nhận dạng loài dựa vào trình tự matK của P. trimera X1
Đối với các trình tự matK, kết quả Megablast cho kết quả bắt cặp trước hết với các loài thuộc chi Paramignya, điển hình như loài P. confertifolia (HG004970.1) nguồn gốc ở Yunnan, Trung Quốc ở mức 99,48%. Trình tự matK của một loài thuộc P. lobata với số truy cập (AB 762387.1) có chiều dài 1402 nucleotide với mức độ giống nhau tới 99,48% và độ che phủ (query cover) đạt 99%. Cho đến thời điểm hiện tại, ngoài kết quả xác định trình tự matK của nghiên cứu này chưa có trình tự tham chiếu matK của loài Xáo tam phân P. trimera. Kết quả bắt cặp với một số loài cùng chi Paramignya như P. confertifolia và P. lobata tiếp đó là các loài Triphassia trifolia, Atalantia bicolaris, Atalantia roxburghiana, Atalantia kwangtungensis, Atalantia spinosa và Citrus spp. cũng phù hợp với mối quan hệ của chi Paramignya với các chi có mối quan hệ họ hàng gần như Triphasia, Atalantia và Citrus (hình 3.17).
Hình 3.17. Kết quả Megablast sử dụng trình tự truy vấn matK của P. trimera X1
Để xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các trình tự matK của các loài trong nghiên cứu này với các trình tự tham chiếu trong CSDL NCBI, kết quả phân tích Blast tree view cho thấy mối quan hệ tiến hóa của các loài thuộc chi Paramygnia với các loài gần gũi được thể hiện ở Hình 3.18.
Hình 3.18. Cây quan hệ tiến hóa của P. trimera với các loài họ hàng phân tích bằng trình tự matK
Ghi chú: Mối quan hệ tiến hóa thể hiện bằng mô hình cây được xây dựng bằng công cụ Blast tree view của NCBI sử dụng trình tự truy vấn P. trimera. Vị trí đánh dấu màu vàng trong hình thể hiện vị trí trong mối quan hệ của P.trimera với các loài có mối quan hệ gần gũi.
Kết quả cho thấy, các trình tự P. trimera (đại diện là P. trimera X1) nằm trong một nhánh riêng và có quan hệ rất gần gũi với P. confertiforlia và P. lobata, đồng thời là một nhánh trong 1 nhóm lớn gồm 4 loài (polyphyletic group). Như vậy, chỉ thị matK có thể nhận dạng và phân biệt loài P. trimera so với các loài thuộc chi Paramignya khác bao gồm P. confertifolia, P. lobata. Chođến thời điểm hiện nay, chưa có nhiều nghiên cứu về hệ thống học cũng như mối quan hệ di truyền giữa các loài thuộc chi Paramignya. Việc xác định trình tự nucleotide mới chỉ thực hiện ở một số loài P. armata, P. confertifolia, P. scandens,
P. monophylla và P. lobata với các dữ liệu rời rạc do những nghiên cứu về các loài này còn hạn chế, đồng thời cũng do sự giới hạn về phân bố địa lý trong tự nhiên của các loài này chỉ tập trung nhiều ở một số nước trong khu vực Đông Nam Á và một số vùng cận nhiệt như Indonesia, Việt Nam, Trung Quốc và Australia và một phần
ở Nhật Bản.
3.3.2.2. Nhận dạng loài dựa vào trình tự rbcL của P. trimera X1
Tương tự, kết quả Megablast sử dụng các trình tự rbcL cho kết quả bắt cặp với trình tự của loài Murrays paniculata, P. confertifolia, Atalantia
kwangtungensis và một số loài thuộc chi Citrus (Hình 3.19). Trong đó các thông số kết quả Megablast đối với loài M. paniculata (số truy cập MT747442.1) với Max score và Total score (974), mức độ che phủ của trình tự truy vấn (91%) và mức độ giống nhau đạt 98,55%. Đối với loài P. confertifolia (số truy cập KF181542.1) với Max score và Total score (970), độ che phủ đối với trình tự truy vấn 88%, và mức độ giống nhau đạt 99,26%. Do trình tự rbcL của loài P.
trimera hiện nay chưa có trình tự tham chiếu trong NCBI cho nên kết quả này gợi ý rằng với chỉ thị rbcL, P. trimera có mối quan hệ gần với các loài thuộc loài P. confertifolia, Murraya paniculata, Citrus polytrifolia.
Hình 3.19. Kết quả Megablast với trình tự truy vấn rbcL của P. trimera X1 Để xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các trình tự rbcL của các loài trong nghiên cứu này với các trình tự tham chiếu trong CSDL NCBI, kết quả phân tích Blast tree view cho thấy P. trimeraX1 nằm trong một nhánh riêng tách biệt khỏi các loài thuộc chi Murrays, Atalantia (hình 3.20).
Kết quả phân tích mối quan hệ tiến hóa của P. trimera (đại diện là P. trimera X1) nằm trong một nhánh riêng, có quan hệ rất gần gũi với P. conferitifolia và tách riêng nhánh với các loài thuộc chi Murrays và Citrus. Trong nghiên cứu này chỉ thị rbcL có khả năng nhận diện và phân biệt chi Paramignya với các chi khác. Theo kết quả thu được, các vùng vùng DNA ITS, matK và rbcL cho phép phân biệt ở mức độ chi Paramignya. Điều này nghĩa là có thể sử dụng chỉ thị rbcL để nhận dạng và phân biệt được các loài ở mức độ chi Paramignya.
Hình 3.20. Cây quan hệ tiến hóa của P. trimera với các loài họ hàng phân tích bằng trình tự rbcL