được xác định dựa vào phương pháp đã được Gornall AG và cộng sự giới thiệu [17] 2.3.4. Xác định hiệu xuất khử khoáng và protein:
Hiệu suất khử protein (DP (%)) và khử khoáng (DA (%)) được xác định dựa trên công thức của Rao và cộng sự (2000).
DP (%) = [(P0*O)-(PR*R)]*100/(P0*O)
DA (%) = [(A0*O)-(AR*R)]*100/(A0*O) Trong đó:
P0, PR: Hàm lượng protein (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý A0, AR: Hàm lượng khoáng (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý O, R: Khối lượng (g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý
2.3.5. Phương pháp xử lí số liệu:
Các số liệu được xử lý trên phần mềm Excel 2007 và DX 8.0.1 phiên bản dùng thử.
PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Hàm lượng protein và hàm lượng khoáng còn lại sau 2 giờ khử khoáng với HCl 1% Bảng 3.1. Hàm lượng protein và hàm lượng khoáng còn lại sau 2 giờ khử khoáng Bảng 3.1. Hàm lượng protein và hàm lượng khoáng còn lại sau 2 giờ khử khoáng
Thảo luận: Hiệu quả khử khoáng đạt 95,33±2,34(%), cho thấy khử khoáng có tác dụng ở những giờ đầu của công đoạn, nếu kéo dài thời gian khử khoáng thì hiệu quả có tăng lên nhưng không nhiều và HCl 1% đồng thời cũng có tác dụng khử protein hiệu quả đạt tới 35,69±3,99(%).
Giải thích: Sở dĩ HCl có tác dụng khử protein vì quá trình khử khoáng sẽ làm cho các mạch vỏ tôm được rỗng hơn tạo điều kiện thuận lợi cho protein ở dạng tự do thoát ngoài nên làm giảm protein trong vỏ tôm nguyên liệu hơn nữa hàm lượng protein còn giảm trong quá trình rửa tách dịch sau khử khoáng.
3.2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ sung enzyme Pepsin enzyme Pepsin 3.2.1. Ảnh hưởng tới hiệu quả khử protein Giá trị Hiệu quả khử protein (%) Hiệu quả khử khoáng (%) Trung bình 35.70±3.99 95.33±2.24
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ sung enzyme Pepsin đến hiệu quả khử protein.
Các chữ cái khác nhau sẽ biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê
Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nhiệt và việc bổ sung Pepsin đến hiệu quả khử protein và phụ lục 5.
Ảnh hưởng của enzyme pepsin: Enzyme pepsin có tác dụng rất tích cực đến quá trình khử protein. Khi có mặt Pepsin hiệu quả khử lên đến trên 70% trong cả hai trường hợp có và không xử lý nhiệt, tăng tương ứng gần 20% so với mẫu có nhiệt-không enzyme và 40% so với mẫu không nhiêt-không có enzyme. Kết quả này có thể là do enzyme Pepsin đã có tác dụng hỗ trợ cắt đứt liên kết giữa protein với các thành phần khác trong vỏ tôm, nhờ đó lượng protein tự do được giải phóng ra nhiều, làm tăng hiệu quả khử protein
Ảnh hưởng của nhiệt: Việc xử lý nhiệt có chỉ có tác dụng khi không bổ sung enzyme Pepsin, mẫu có nhiệt- không enzyme thì hiệu quả khử protein đạt 51,37 % cao hơn mẫu không nhiệt-không enzyme khoảng 13%, sự tăng lên này có ý
nghĩa về mặt thống kê, trong đó hai mẫu có nhiệt-có enzyme và không nhiệt-có enzyme thì hiệu quả khử này đều đạt khoảng 76%.
Việc xử lý nhiệt vỏ tôm trước thủy phân không ảnh hưởng lớn tới hiệu quả khử protein dù mẫu có bổ sung enzyme hay không.
3.2.2. Ảnh hưởng đến hiệu quả khử khoáng:
Kết quảảnh hưởng của xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ sung enzyme đến hiệu quả khử khoáng có khác với hiệu quả khử protein. Pepsin mặc dù có tác dụng làm tăng hiệu quả khử khoáng nhưng mức độ không lớn như với hiệu quả khử protein. Ở cả 2 chế độ, có bỏ sung enzyme pepsin hoặc không bổ sung enzyme pepsin thì việc xử lý nhiệt không ảnh hưởng tới hiệu quả khử protein.
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ sung enzyme Pepsin đến hiệu quả khử khoáng
Các chữ cái khác nhau sẽ biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê
Giải thích: Việc xử lý nhiệt vỏ tôm trước khi thủy phân không ảnh hưởng lớn tới hiệu quả khử khoáng có thể là do thành phần và cấu trúc của chúng: Lớp ngoài cùng của vỏ tôm có cấu trúc chitin-protein bao phủ, lớp vỏ này thường bị hóa cứng khắp bề mặt cơ thể do sự lắng đọng của muối canxi và các chất hữu cơ khác nằm dưới dạng phức tạp do sự tương tác của protein và các chất không hòa tan. Nên tại nhiệt độ 85-900C/15 phút thì nhiệt chưa đủ lớn để phá vỡ được liên kết
3.3. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ enzyme pepsin tới hiệu quả khử protein.
Hình 3.3. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của nồng độ pepsin đến hiệu quả khử
protein và khoáng
Các chữ cái khác nhau sẽ biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê
Quá trình thủy phân để khử protein của phế liệu tôm bằng enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: tỷ lệ E/S, pH, nhiệt độ, thời gian…Trong đó tỷ lệ E/S là một yếu tố quan trọng và ảnh hưởng nhiều đến tốc độ thủy phân.. Khi nồng độ enzyme càng tăng thì phản ứng thuỷ phân cắt đứt liên kết trong phân tử protein xảy ra càng mạnh. Các phân tử protein bị thuỷ phân thành polypeptid, peptid, acid amin… hoà tan vào dung dịch.
Hiệu quả khử protein: Kết quả thí nghiệm ở hình 3.3 cho thấy khi tăng tỷ lệ enzyme bổ sung vào phế liệu vỏ tôm trong khoảng từ 5000 ÷ 15.000 UI thì hiệu quả khử protein tăng tỷ lệ thuận với lượng enzyme pepsin bổ sung. Hiệu quả cao nhất đạt được ở tỷ lệ bổ sung enzyme 15.000 UI. Hiệu quả khử protein vẫn tiếp tục tăng, tại nồng độ 20.000 UI hiệu quả là 87,67% tăng 0,1% so với mẫu có nồng độ 15.000 UI, 91,16% là số liệu đạt tới tại nồng độ 25.000 UI đến nồng độ 30.000 UI hiệu quả bắt đầu có xu hướng giảm xuống còn 90,21%.
Ở những nồng độ đầu, hiệu quả khử protein tăng là do enzyme có tác dụng
thủy phân protein nhưng một khi nồng độ enzyme đã bão hoà với nồng độ cơ chất,
dù tăng nồng độ enzyme bao nhiêu đi nữa thì vận tốc của quá trình thủy phân cũng rất ít thay đổi thậm trí giảm xuống kéo theo hiệu quả giảm dần đi.
Hiệu quả khử khoáng: Trong khi đó hiệu quả khử khoáng hầu như không có sự khác biệt đáng kể giữa các mẫu với các tỷ lệ Pepsin bổ sung khác nhau. Hiệu quả khử khoáng của các mẫu đều dao động quanh giá trị 99,18% ±0,09. Hiệu quả khử khoáng tại mẫu có nồng độ enzyme 15.000 UI là 99,7 ±0.02. Tiếp tục tăng nồng độ enzyme pepsin thì hiệu quả khử khoáng cũng có tăng lên nhưng % tăng lên là rất nhỏ, chỉ khoảng 0,1-0,2%.
Từ các phân tích ở trên cho thấy trong giới hạn tỷ lệ bổ sung pepsin từ 5000 – 30.000 UI thì tỷ lệ 15.000 UI là phù hợp hơn cả cho mục đích khử khoáng cũng như khử protein.
3.4. Ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình thủy phân của enzyme pepsin.
Trước khi thực hiện tối ưu hóa quá trình thủy phân bằng enzyme pepsin thực hiện nghiên cứu để phân tích ảnh hưởng các nhân tố là rất quan trọng. Qua đó ta có thể biết được mức độảnh hưởng của các yếu tố và đưa ra được khoảng tối ưu thích hợp.
Kết quả thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố theo bố trí thí nghiệm ở mục 2.2.4.4 được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả thăm dò ảnh hưởng của các yếu tố đến hoạt động của enzyme pepsin N Run U1(Nhiệt độ) U2(Nồng độ) U3(Thời gian) Hiệu quả khử Pro(%) Hiệu quả khử khoáng (%) 1 2 28 5000 6 47.3518 96.8806 2 1 28 5000 6 37.4372 97.8705 3 14 40 5000 6 49.7713 98.4372 4 21 40 5000 6 58.4359 98.5553 5 17 28 20000 6 79.3109 98.6715 6 16 28 20000 6 76.3682 99.2508 7 10 40 20000 6 91.0879 99.2230 8 8 40 20000 6 74.9746 97.3825 9 11 28 5000 18 46.2840 97.6411 10 7 28 5000 18 50.4299 97.9375 11 19 40 5000 18 63.7321 98.3295 12 22 40 5000 18 64.2634 98.1674 13 13 28 20000 18 78.0637 98.5729 14 3 28 20000 18 84.7673 98.2575 15 5 40 20000 18 88.8396 99.3035 16 9 40 20000 18 90.2868 99.4822 17 18 34 12500 12 51.8057 97.6681 18 12 34 12500 12 55.4906 97.8348 19 6 34 12500 12 57.3284 97.8952 20 20 34 12500 12 51.8057 97.6681 21 4 34 12500 12 55.4906 97.8348 22 15 34 12500 12 57.3284 97.8952
Tiến hành phân tích kết quả trên phần mềm DX theo mô hình 2FI thu được đồ thị biểu diễn mức độảnh hưởng của các nhân tốở hình 3.4, hình 3.5 và số liệu ở bảng 3.2.
Hình 3.4. Bảng đánh giá mức độảnh hưởng của các nhân tố
Kết quả cho thấy: nồng độ là yếu tố có ảnh hưởng lớn nhất đến hiệu quả khử protein với mức độ đóng góp 69,73%, tiếp đến là nhiệt độ với 7,63% và thời gian với 3,11%. Sự tương tác giữa các yếu tố với nhau có sự đóng góp rất nhỏ đến hiệu quả khử protein và sự đóng góp của tất cả các tương tác đều không vượt quá 1%.
Đồ thị Half-Normal ở hình 3.5 cho thấy rõ ràng hơn kết luận đã nhận xét trên hình 3.4, các yếu tố càng có ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu càng nằm xa đường thẳng.
Phân tích ảnh hưởng của các nhân tố đến hiệu quả khử protein:
Ảnh hưởng của nhân tố nhiệt độ: Khi xét tới yếu tố nhiệt độ thì hiệu quả thủy phân protein cho kết quả khá cao và sự tăng của hiệu quả tỷ lệ thuận với sự tăng của nhiệt độ thủy phân. Hiệu quả khử tăng lên 10% từ 60 đến khoảng 70% khi nâng nhiệt độ từ điểm khảo sát dưới 280C lên điểm khảo sát trên 400C. Khi nhiệt độ tăng trong một khoảng rộng mà hiệu quả cũng không tăng nhiều nên có thể rút ngắn miền thí nghiệm bằng cách nâng nhiệt độ cận dưới lên. Tuy nhiên để thấy rõ được sự thay đổi của hiệu quả khử protein thì nhiệt độ vẫn được giữ nguyên.
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhân tố nhiệt độ
Ảnh hưởng của nhân tố nồng độ: Theo Anova thì nồng độ có ảnh hưởng dương lớn nhất tới hiệu quả thủy phân protein, hiệu quả tăng lên đáng kể tới khoảng 25% trong khoảng biến thiên nồng độ 15000 UI, nồng độ càng cao thì hiệu quả thủy phân càng lớn.
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nhân tố nồng độ
Ảnh hưởng của thời gian thủy phân: Mô hình ảnh hưởng của thời gian gần như không có độ dốc, tại nhiệt độ 340C và nồng độ 12500 UI thì hiệu quả chỉ tăng lên khoảng 5% khi thời gian tăng lên tới 12 giờ. Hiệu quả thủy phân tăng không nhiều khi thời gian tăng nên có thể rút ngắn thời gian thủy phân trong thí nghiệm tối ưu, nhưng do điều kiện thí nghiệm nên dải thời gian vẫn được giữ nguyên
Qua những phân tích trên có thể đưa ra kết luận, các yếu tố nhiệt độ, thời gian, nồng độ đều ảnh hưởng tới hiệu quả khử protein của enzyme Alcalase, tuy nhiên mỗi một yếu tố có mức độ ảnh hưởng lớn nhỏ khác nhau. Kết quả này cũng phù hợp với phân tích Anova.
Đồ thị biểu diễn sự tương tác giữa các nhân tố được thể hiện ở hình 3.9 và 3.10.
Nồng độ (B) có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả khử protein nên hiệu quả khử protein tăng lên một cách đáng kể cùng với sự tăng lên của nồng độ: Tại nhiệt độ 280C nếu sử dụng enzyme pepsin có nồng độ 5000 UI thì hiệu quả thủy phân chỉ đạt khoảng 41%, trong khi đó ở nồng độ 20000 UI hiệu quả lên tới trên 78%. Như vậy khi nồng độ pepsin càng cao khả năng tiếp xúc với cơ chất protein càng lớn dẫn đến hiệu quả khử protein càng cao. Khi cố định thời gian ở 12h , với nồng độ 5000 UI, hiệu quả thủy phân tương ứng với nhiệt độ 280C và 400C lần lượt là 41%, và 49%; với nồng độ 20000 UI hiệu quả khử sẽ là 76% và 78% ở 280C và 400C. Điều đó cho thấy, nhiệt độ có ảnh hưởng đến hiệu quả khử protein nhưng sựảnh hưởng này là không quá lớn.
Hình 3.10. Sự tương quan giữa nhiệt độ và thời gian
Thời gian (C) có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả khử protein nên hiệu quả khử protein tăng cùng với sự tăng lên của thời gian: Tại nhiệt độ 280C nếu thời gian thủy phân là 6 giờ thì hiệu quả thủy phân đạt khoảng 55%, trong khi đó nếu tăng thời gian thủy phân lên 18 giờ thì hiệu quả cũng chỉ đạt khoảng 62%. Khi cố định nồng độ 12500 UI , với thời gian 6 giờ, hiệu quả thủy phân tương ứng với nhiệt độ 280C và 400C lần lượt là 55%, và 63%; với thời gian 18 giờ hiệu quả khử sẽ là 61% và 69% ở 280C và 400C. Điều đó cho thấy, nhiệt độ có ảnh hưởng đến hiệu quả khử protein nhưng sựảnh hưởng này là không quá lớn.
3.5. Kết quả tối ưu hóa quá trình thủy phân protein bằng enzyme pepsin.
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố cho thấy không cần thiết phải thay đổi miền thí nghiệm dự kiến ở thí nghiệm tối ưu. Do đó miền thí nghiệm được giữ nguyên như sau:
Nhiệt độ:[28-400C] Nồng độ:[5000-20000UI] Thời gian:[6-18h]
Bảng 3.3. Kết quả thí nghiệm tối ưu quá trình thủy phân bằng enzyme Pepsin
N U1(nhiệt độ ) U2(nồng độ ) U3(thời gian ) X0 X1 X2 X3
Hiệu quả khử protein (%) 1 28 5000 12 1 -1 -1 0 41,8853 2 40 5000 12 1 1 -1 0 65,2987 3 28 20000 12 1 -1 1 0 45,6435 4 40 20000 12 1 1 1 0 86,9537 5 28 12500 6 1 -1 0 -1 34,9902 6 40 12500 6 1 1 0 -1 61,9086 7 28 12500 18 1 -1 0 1 46,7679 8 40 12500 18 1 1 0 1 85,5505 9 34 5000 6 1 -1 -1 -1 41,0810 10 34 20000 6 1 1 1 -1 58,5650 11 34 5000 18 1 -1 -1 1 57,1149 12 34 20000 18 1 1 1 1 76,0922 13 34 12500 12 1 0 0 0 75,4411 14 34 12500 12 1 0 0 0 73,2986 15 34 12500 12 1 0 0 0 71,3440
Kết quả xử lý số liệu thu được ở bảng 3.3 trên phần mềm DX được trình bày ở bảng 3.4, bảng 3.5, bảng 3.6.
Căn cứ vào kết quảở bảng 3.4 chọn dạng hàm bậc 2 (Quadratic) cho hàm hồi
qui, bởi vì các giá trị thống kê ứng với dạng hàm này có đều đảm bảo: p-value bằng
0.0008<0.005, lack of Fit có p-value bằng 0.4763, sự chênh lệch của Adj-R Squared
với Pre- R Squared < 0.2 cho biết phương trình hồi quy có khả năng dự báo.
Bảng 3.4. Kết quả phân tích bậc cho mô hình hồi qui
Tóm tắt các chỉ số thống kê cơ bản
Sequential
Lack of
Fit Adjusted Predicted
Source p-value p-value R-Squared
R- Squared Linear 0.0002 0.0547 0.7752488 0.7327523 2FI 0.6673 0.0442 0.74312728 0.6847107 Quadratic 0.0008 0.4763 0.98246654 0.9299725 Cubic 0.4763 0.98464392 Suggested Aliased
Bảng 3.5. Kết quả phân tích ANOVA của mô hình hồi qui đã chọn Sum of Mean F p-value
Source Squares df Square Value Prob > F
Model 3861.55 9 429.06 88.16 <0.0001 significant A-nhiet do 2126.32 1 2126.32 436.92 < 0.0001 B-nong do 478.56 1 478.56 98.33 0.0002 C-thoi gian 594.79 1 594.79 122.22 0.0001 AB 80.07 1 80.07 16.45 0.0098 AC 35.19 1 35.19 7.23 0.0433 BC 0.56 1 0.56 0.11 0.7488 A^2 189.68 1 189.68 38.98 0.0015 B^2 144.62 1 144.62 29.72 0.0028 C^2 292.43 1 292.43 60.09 0.0006 Residual 24.33 5 4.87
Lack of Fit 15.81 3 5.27 1.24 0.4763 not significant Pure Error 8.52 2 4.26
Cor Total 3885.88 14
Kết quả phân tích Anova cho thấy mô hình bậc 2 đã chọn có sự tương thích tốt với số liệu thực nghiệm vì kiểm định tính không phù hợp (Lack of fit) không có
ý nghĩa (p=0.4763>0,05) và kiểm định tính tương thích của mô hình (model) có p<0,0001. Tất cả các biến đơn A, B, C, biến tương tác AB, AC, biến bình phương A2, B2, C2 trừ biến tương tác BC (giữa nồng độ và thời gian) đều có p <0,05 chứng tỏ chúng đều có ảnh hưởng đến hàm mục tiêu là hiệu quả khử protein và tương tác
