Quy trình của Trung Tâm Chế Biến có ưu điểm là đơn giản, không đòi hỏi máy móc thiết bị phức tạp. Do đó, rất dễ dàng để sản xuất lớn. Tuy nhiên thời gian sản xuất kéo dài và nồng độ hóa chất sử dụng còn khá cao, vẫn chưa có hướng xử lý nước thải từ quá trình sản xuất
Hình 1.6. Quy trình của Trung Tâm Chế Biến Đại Học Thủy Sản HCl 7% T0 phòng t =24h w/v=1/5 NaOH 6% T0 phòng T = 24h w/v = 1/5 NaOH 40% T0 = 800C T =6,5h w/v = 1/10 Phơi, sấy Phế liệu tôm Rửa sơ bộ Khử khoáng Ngâm rửa trung tính Khử protein Rửa trung tính Deacetyl hóa Ngâm rửa trung tính Chitosan
1.4.3. Quy trình sử dụng enzyme Papain để sản xuất chitosan ( Trần Thị Luyến, 2003)
Hình 1.7. Quy trình sử dụng Emzyme papain để sản xuất chitosan ( Trần Thị Luyến, 2003) HCl 10% T0 phòng T =5h w/v =1/10 HCl 10% T0 phòng T =5h w/v =1/10
Vỏ tôm khô Vỏ tôm tươi
Ngâm HCl Ngâm HCl Rửa trung tính Khử protein Rửa sạch Làm khô Deacetyl Rửa trung tính Chitosan Chitin
Bảng 1.6. Một số chỉ tiêu chất lượng của chitosan từ quy trình sử dụng
Emzyme papain để sản xuất Chitosan (Trần Thị Luyến, 2003).
Chỉ tiêu Kết quả Chỉ tiêu Kết quả Màu sắc Trắng trong Độ nhớt 15,25 Trạng thái Mềm mại Độ deacety 78,25 Độẩm 10,10% Nts 8,25 Hàm lượng tro 0,68% Hiệu suất 41,25 Hàm lượng các chất
không tan 0.92% Độ tan 98,36
1.4.4. Quy trình sản xuất chitin của Holan da và Netto
Hình 1.8. Quy trình sản xuất chitin của Holan da và Netto pH = 8,5 t0 = 550C
tỷ lệ E/NL = 3% w/v = 1/1
Khử protein bằng enzyme Alcalase Phế liệu tôm Chiết Astaxanthin bằng dầu nành và hỗn hợp dung môi Phần bã Ly tâm (40C, 15 phút) Rửa trung tính Khử khoáng HCl 2,5 %,2h,t0 phòng Chitin Sấy khô (600C, 16h) Bột protein Sấy lạnh Phần dịch nổi phía trên
Ngoài ra, còn có rất nhiều các nghiên cứu sản xuất chitin bằng phương pháp sinh học khác trên thế giới cũng như tại Việt Nam như:
Gagne và Simpson (1993) đầu tư ứng dụng chymotrypsin và papain để khử protein của phế liệu tôm. Nghiên cứu chỉ ra protein còn lại trong phế liệu sau khi thủy phân là 1,3 % khi xử lý bằng chymotrypsin và 2,8% với papain.
Theo Jen-Kuo Yang và cộng sự (1999) sử dụng protease từ Bacillus subtilis ở nhiệt độ 500C, pH 8,0 để khử protein từ vỏ tôm, vỏ ghẹ, vỏ tôm hùm trong công nghệ sản xuất chitosan. Kết quả đã loại bỏ được 88%, 67%, 83% protein theo thứ tự.
Synowiecki và cộng sự (2002) nghiên cứu ứng dụng Alcalase để khử protein của phế liệu vỏ tôm Crangon cragon nhằm thu hồi chitin và protein. Ban đầu vỏ tôm Crangon cragon được khử khoáng sơ bộ bằng dung dịch HCl 10% ở 200C trong 30 phút và khử protein bởi enzyme thương mại Alcalase ở 550C và pH 8,5. Dịch thủy phân thu được chứa 63% protein so với vật chất khô (Nx6,25). Hàm lượng protein còn lại sau thủy phân khoảng 4% có thể do trong quá trình thủy phân có sự kết hợp khử protein bằng NaOH 4M.
Holanda và Netto, (2006), nghiên cứu thu hồi 3 thành phần chính của phế liệu tôm, protein, chitin, astaxanthin bằng việc sử dụng enzyme Alcalase và pacreatin. Theo tác giả trong phế liệu tôm Xiphopenaeus kroyeri có chứa 39,42% protein; 31,98% tro; và 19,92% chitin. Tiến hành thủy phân khử protein bằng enzyme Alcalase tại các điều kiện: tỷ lệ enzyme/nguyên liệu 3%, nhiệt độ 600C, pH 8,5. Kết quả cho thấy rằng Alcalase có hiệu quả thu hồi protein, astaxanthin, chitin cao hơn so với trypsin, chimotripsin và carboxypeptidase tăng hiệu quả thu hồi protein từ 57,5% lên 64,6% và astaxanthin từ 4,7 lên 5,7mg/100g phế liệu khô.
Rao và Stevens (2005) đã sản xuất Chitin bằng cách ủ xi lô đầu và vỏ tôm với Lactobacillus plantarum 541. Hiệu suất thu hồi Chitin từ đầu và vỏ tôm là 4,5% và 13% với đầu tôm đã khử được 83% protein và 88% khoáng, khử được 66% protein và 63% khoáng từ vỏ tôm.
Gần đây Trường đại học Nha Trang đã đi sâu nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất ở bước cao hơn theo hướng giảm thiểu sử dụng hóa chất trong xử lý,
ứng dụng công nghệ enzyme và có nhiều kết quả được công bố đã góp phần đáp ứng yêu cầu cấp bách xử lý phế liệu tôm đông lạnh và trước những yêu cầu khắt khe hơn về chất lượng chitin - chitosan trên thị trường.
Trần Thị Luyến và Đỗ Thị Bích Thủy (2006) nghiên cứu nuôi cấy trực tiếp vi khuẩn Bacillussubtilis để loại bỏ protein ra khỏi vỏ của phế liệu tôm. Sau 24h phần trăm protein còn lại trong phế liệu tôm so với mẫu chưa xử lý là 12,99%.
PHẦN 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Nguyên liệu vỏ tôm 2.1.1. Nguyên liệu vỏ tôm
Vỏ tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) được chọn là đối tượng nghiên cứu. Vỏ được lấy từ nguyên liệu tôm Thẻ chân trắng chế biến tại Công ty Cổ Phần Nha Trang Seafoods (F17), Khánh Hòa.
2.1.2. Enzyme Protease[16]
- Enzyme Pepsin: Enzyme Pepsin của Merck được chiết từ niêm mạc dạ dày lợn có pH trong khoảng từ 1,5 đến 4.
2.1.3. Hóa chất sử dụng.
Tất cả các hóa chất sử dụng trong đề tài đều ở dạng tinh khiết dùng cho phân tích.
2.1.4 Thiết bị:
Bảng 2.1. Một số thiết bị thí nghiệm
Tên thiết bị Bểổn nhiệt Máy vortex Thiết bị đo UV vis
Model Memmert WNB 29
(L1), 29 lít ZX3 UVmini-1240
Hãng sản xuất Memmert - Đức VELP- Italy
Công ty (Nhà máy) và nước sản xuất: Shimazu,
Nhật
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp thu nhận mẫu
Nguyên liệu vỏ tôm được thu từ phân xưởng chế biến, Công Ty Cổ Phần Nha Trang Seafoods (F17). Yêu cầu nguyên liệu phải còn tươi, không có mùi lạ, không bị biến đỏ, không lẫn tạp chất. Nguyên liệu sau khi lấy cho ngay vào thùng xốp cách nhiệt có chứa nước đá và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm. Nguyên liệu được loại bỏ tạp chất, ép sơ bộ để tách nước và tiến hành làm thí nghiệm. Trong trường hợp chưa làm ngay thì nguyên liệu được cho vào túi polymer (mỗi túi 1kg), và bảo quản đông ở nhiệt độ -200C. Thời gian bảo quản 1 tháng.
2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm.
- Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ sung enzyme tới khả năng khử protein của enzyme Pepsin bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
- Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ Pepsin đến hiệu quả khử khoáng và khử protein bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
- Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố và tối ưu quá trình thủy phân protein với enzyme pepsin bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
2.2.3. Bố trí thí nghiệm tổng quát.
a. Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Tỉ lệ E/NL: [5000-20000] Nhiệt độ: [28-430C] Thời gian: [6÷18]
Vỏ tôm
Tối ưu hóa quá trình khử protein bằng E.Pepsin
Chitin
Đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến hiệu quả
khử protein của enzyme pepsin
Xác định hàm lượng protein và hàm
lượng khoáng sau 2 giờ khử khoáng
Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ Pepsin đến hiệu quả khử khoáng và
Nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố đến hoạt động của enzyme pepsin
Tỉ lệ E/NL: [5000-20000] Nhiệt độ: [28-430C] Thời gian: [6÷18]
b. Thuyết minh quy trình:
Nguyên liệu vỏ tôm được đưa vào thí nghiệm đảm bảo còn tươi, không bị
biến đen, biến đỏ hay có mùi lạ, không lẫn tạp chất.
Trước khi thủy phân, tiến hành xác định hàm lượng protein và hàm lượng khoáng còn lại sau quá trình khử khoáng để làm cơ sở cho các công đoạn sau.
Tiếp theo, nguyên liệu được đánh giá ảnh hưởng của nhiệt đến khảnăng thủy phân protein bằng cách xử lý nguyên liệu ở 90oC trong 15 phút, đồng thời kết hợp đánh giá ảnh hưởng của enzyme đến khả năng thủy phân protein bằng cách bổ sung enzyme pepsin 10.000 UI.
Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ enzyme pepsin đến hiệu quả khử protein và hiệu quả khử khoáng của enzyme pepsin là bước kế tiếp của tiến trình thực hiện.
Sau đó, đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố tác động đến quá trình thủy phân protein.
Với các yếu tố ảnh hưởng, tiến hành tối ưu hóa quá trình thủy phân protein trên vỏ tôm sao cho hiệu quả thủy phân đạt được là cao nhất.
2.2.4. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số kỹ thuật.
2.2.4.1. Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng protein và hàm lượng khoáng còn lại sau quá trình khử khoáng 2 giờ. còn lại sau quá trình khử khoáng 2 giờ.
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng protein và hàm lượng khoáng còn lại sau 2 giờ khử khoáng
Vỏ tôm
Khử khoáng HCl 1%, 2 giờ, nhiệt độ phòng, NL ban đầu/HCl=1/4
Kiểm tra hàm lượng protein và khoáng còn lại
2.2.4.2. Đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ sung enzyme Pepsin
a. Sơ đồ thí nghiệm.
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ sung enzyme Pepsin
b. Mô tả quy trình thực hiện
Vỏ tôm nguyên liệu: Được rã đông ở nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút.
Yêu cầu: Nguyên liệu không lẫn tạp chất, thịt hoặc đầu tôm, vỏ tôm không bị biến đen sau khi rã đông.
- Chuẩn bị mỗi thí nghiệm: Mỗi mẫu dùng 100g vỏ tôm trong bình tam giác 500ml. Thí nghiệm 1: Bổ sung 300ml nước đun cách thủy trên bếp điện 15 phút để nhiệt độ trong mẫu đạt 85-900C. Sau đó, tách bỏ dịch và làm nguội bã đến nhiệt độ phòng, sau đó bổ sung HCl 1%, tỷ lệ ¼, và khuấy đảo đều. Sau 2h xử lý với HCl tiến hành
Không bổ sung enzyme Bổ sung pepsin 10.000 UI Không bổ sung enzyme Bổ sung pepsin 10.000 UI Vỏ tôm Không xử lý nhiệt Xử lý nhiệt Khử protein(370C, 15 giờ) Kiểm tra hàm lượng protein còn lại Đảnh giá hiệu quả khử Chọn chế độ xử lý TN1 TN2 ĐC ĐC
tách dịch và điều chỉnh pH về 2, bổ sung 10.000 UI Pepsin (so với khối lượng mẫu ban đầu) để thực hiện quá trình khử protein trong 15h ở 370C. Khi kết thúc thời gian khử, tiến hành rửa sạch mẫu, phơi khô, bảo quản trong túi PE để phân tích hàm lượng khoáng và protein còn lại.
Thí ngiệm 2: Tiến hành tương tự thí nghiệm 1 nhưng không xử lý nhiệt nguyên liệu trước khi xử lý HCl.
Mẫu đối chứng không bổ sung enzyme Pepsin.
2.2.4.3. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ enzyme pepsin đến hiệu quả khử
protein và hiệu quả khử khoáng
a. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ enzyme
pepsin đến hiệu quả khử protein và hiệu quả khử khoáng
b. Mô tả quy trình thực hiện: Vỏ tôm Khử khoáng Xác định lượng protein và khoáng còn lại 5000U I 10.000U I 15.000U I 25.000UI 20.000U I 0 UI 30.000U I Khử protein bằng E.Pepsin
Chuẩn bị mỗi nồng độ 3 mẫu, mỗi mẫu cân 100g vỏ tôm trong bình tam giác 500ml, sau đó bổ sung HCl 1%, tỷ lệ ¼, và khuấy đảo đều. Sau 2h xử lý với HCl tiến hành tách dịch và điều chỉnh pH về 2
Thủy phân bằng enzyme pepsin: Các mẫu sau khi tách dịch khử khoáng
được tiến hành bổ sung E.Pepsin theo các nồng độ khác nhau trong dải nghiên cứu
sau đó giữở 370C trong 15 giờ.
Sau đó kiểm tra hàm lượng protein và khoáng còn lại để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ tới hiệu quả khử.
2.2.4.4. Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân bằng pepsin. phân bằng pepsin.
Tiến hành đánh giá mức độ ảnh hưởng của các nhân tố theo mô hình 2-Level Factorial với ba biến là:
Nhiệt độ thủy phân(0C): U1 =[28-40]
Nồng độ enzyme Pepsin(UI): U2 =[5000-20000]
Bảng 2.2. Ma trận bố trí thí nghiệm N Run U1(Nhi0 ệtđộ C) U2(Nồng đô UI) U3(Thời gian h) X0 X1 X2 X3 Hiệu suất khử protein (%) Hiệu quả khử khoáng (%) 1 2 28 5000 6 1 -1 -1 -1 2 1 28 5000 6 1 -1 -1 -1 3 14 40 5000 6 1 1 -1 -1 4 21 40 5000 6 1 1 -1 -1 5 17 28 20000 6 1 -1 1 -1 6 16 28 20000 6 1 -1 1 -1 7 10 40 20000 6 1 1 1 -1 8 8 40 20000 6 1 1 1 -1 9 11 28 5000 18 1 -1 -1 1 10 7 28 5000 18 1 -1 -1 1 11 19 40 5000 18 1 1 -1 1 12 22 40 5000 18 1 1 -1 1 13 13 28 20000 18 1 -1 1 1 14 3 28 20000 18 1 -1 1 1 15 5 40 20000 18 1 1 1 1 16 9 40 20000 18 1 1 1 1 17 18 34 12500 12 1 0 0 0 18 12 34 12500 12 1 0 0 0 19 6 34 12500 12 1 0 0 0 20 20 34 12500 12 1 0 0 0 21 4 34 12500 12 1 0 0 0 22 15 34 12500 12 1 0 0 0
2.2.4.5. Thí nghiệm tối ưu hóa quá trình khử protein bằng enzyme Pepsin
Mục đích của quá trình tối ưu là chọn được một chế độ công nghệ thích hợp cho quá trình loại bỏ protein từ vỏ tôm bằng enzyme Pepsin sao cho hàm lượng protein khử được là cao nhất.
Dựa vào kết quả phân tích ảnh hưởng của các yếu tố trong quá trình thủy phân ở thí nghiệm trên kết hợp với thí nghiệm thăm dò và kế thừa các kết quả nghiên cứu trước đây, miền nghiên cứu của thí nghiệm tối ưu sẽ được xác lập.
Dự kiếncác yếu tố cố định là: - pH = 2
- Tỉ lệ nước /NL = 3:1
Các thông số cần tối ưu là:
- Nhiệt độ thủy phân [28 -430C]. - Thời gian thủy phân [6-18 h].
- Nồng độ enzyme Pepsin [5.000-20.000 UI].
Hàm mục tiêu là: Hiệu quả khử protein trong quá trình thủy phân protein bằng E. Pepsin (Y (%)) Max.
Ma trận thí nghiệm thiết kế theo mô hình Box-Benken và được trình bày ở bảng 2.3
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm với biến ảo của công
đoạn khử protein bằng enzyme Pepsin.
N Run U1(nhiệt độ0C) U2(nồng độ UI) U3(Thời gian h) X0 X1 X2 X3 Hiệu suất khử protein (%) Hiệu quả khử khoáng (%) 1 9 28 5000 12 1 -1 -1 0 2 13 40 5000 12 1 1 -1 0 3 15 28 20000 12 1 -1 1 0 4 5 40 20000 12 1 1 1 0 5 3 28 12500 6 1 -1 0 -1 6 10 40 12500 6 1 1 0 -1 7 14 28 12500 18 1 -1 0 1 8 1 40 12500 18 1 1 0 1 9 7 34 5000 6 1 -1 -1 -1 10 12 34 20000 6 1 1 1 -1 11 2 34 5000 18 1 -1 -1 1 12 11 34 20000 18 1 1 1 1 13 6 34 12500 12 1 0 0 0 14 8 34 12500 12 1 0 0 0 15 4 34 12500 12 1 0 0 0
U1: nhiệt độ thủy phân (0C) U2: Thời gian thủy phân (h)
U3: nồng độ enzyme (UI)
PTHQ: Y = b0 + b1X1 +b2X2 +b3X3 +b12X12 +b13X13 +b23X23+b1’X12 + b2’X22 +b3’X32
2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA HỌC
2.3.1. Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 1050 C theo TCVN 3700-1990. 3700-1990.
2.3.2. Xác định hàm lượng khoáng bằng phương pháp nung ở 5500C theo TCVN 4588–1988. 4588–1988.
2.3.3. Xác định hàm lượng protein còn lại: Hàm lượng protein còn lại trên chitin được xác định dựa vào phương pháp đã được Gornall AG và cộng sự giới thiệu [17] được xác định dựa vào phương pháp đã được Gornall AG và cộng sự giới thiệu [17] 2.3.4. Xác định hiệu xuất khử khoáng và protein:
Hiệu suất khử protein (DP (%)) và khử khoáng (DA (%)) được xác định dựa trên công thức của Rao và cộng sự (2000).
DP (%) = [(P0*O)-(PR*R)]*100/(P0*O)
DA (%) = [(A0*O)-(AR*R)]*100/(A0*O) Trong đó:
P0, PR: Hàm lượng protein (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý
A0, AR: Hàm lượng khoáng (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý
O, R: Khối lượng (g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý
2.3.5. Phương pháp xử lí số liệu:
Các số liệu được xử lý trên phần mềm Excel 2007 và DX 8.0.1 phiên bản dùng thử.
PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Hàm lượng protein và hàm lượng khoáng còn lại sau 2 giờ khử khoáng với HCl 1% Bảng 3.1. Hàm lượng protein và hàm lượng khoáng còn lại sau 2 giờ khử khoáng Bảng 3.1. Hàm lượng protein và hàm lượng khoáng còn lại sau 2 giờ khử khoáng
