- Enzyme Pepsin: Enzyme Pepsin của Merck được chiết từ niêm mạc dạ dày lợn có pH trong khoảng từ 1,5 đến 4.
2.1.3. Hóa chất sử dụng.
Tất cả các hóa chất sử dụng trong đề tài đều ở dạng tinh khiết dùng cho phân tích.
2.1.4 Thiết bị:
Bảng 2.1. Một số thiết bị thí nghiệm
Tên thiết bị Bểổn nhiệt Máy vortex Thiết bị đo UV vis
Model Memmert WNB 29
(L1), 29 lít ZX3 UVmini-1240
Hãng sản xuất Memmert - Đức VELP- Italy
Công ty (Nhà máy) và nước sản xuất: Shimazu,
Nhật
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp thu nhận mẫu
Nguyên liệu vỏ tôm được thu từ phân xưởng chế biến, Công Ty Cổ Phần Nha Trang Seafoods (F17). Yêu cầu nguyên liệu phải còn tươi, không có mùi lạ, không bị biến đỏ, không lẫn tạp chất. Nguyên liệu sau khi lấy cho ngay vào thùng xốp cách nhiệt có chứa nước đá và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm. Nguyên liệu được loại bỏ tạp chất, ép sơ bộ để tách nước và tiến hành làm thí nghiệm. Trong trường hợp chưa làm ngay thì nguyên liệu được cho vào túi polymer (mỗi túi 1kg), và bảo quản đông ở nhiệt độ -200C. Thời gian bảo quản 1 tháng.
2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm.
- Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ sung enzyme tới khả năng khử protein của enzyme Pepsin bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
- Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ Pepsin đến hiệu quả khử khoáng và khử protein bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
- Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố và tối ưu quá trình thủy phân protein với enzyme pepsin bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
2.2.3. Bố trí thí nghiệm tổng quát.
a. Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Tỉ lệ E/NL: [5000-20000] Nhiệt độ: [28-430C] Thời gian: [6÷18]
Vỏ tôm
Tối ưu hóa quá trình khử protein bằng E.Pepsin
Chitin
Đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến hiệu quả
khử protein của enzyme pepsin
Xác định hàm lượng protein và hàm
lượng khoáng sau 2 giờ khử khoáng
Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ Pepsin đến hiệu quả khử khoáng và
Nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố
đến hoạt động của enzyme pepsin
Tỉ lệ E/NL: [5000-20000] Nhiệt độ: [28-430C] Thời gian: [6÷18]
b. Thuyết minh quy trình:
Nguyên liệu vỏ tôm được đưa vào thí nghiệm đảm bảo còn tươi, không bị biến đen, biến đỏ hay có mùi lạ, không lẫn tạp chất.
Trước khi thủy phân, tiến hành xác định hàm lượng protein và hàm lượng khoáng còn lại sau quá trình khử khoáng để làm cơ sở cho các công đoạn sau.
Tiếp theo, nguyên liệu được đánh giá ảnh hưởng của nhiệt đến khảnăng thủy phân protein bằng cách xử lý nguyên liệu ở 90oC trong 15 phút, đồng thời kết hợp đánh giá ảnh hưởng của enzyme đến khả năng thủy phân protein bằng cách bổ sung enzyme pepsin 10.000 UI.
Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ enzyme pepsin đến hiệu quả khử protein và hiệu quả khử khoáng của enzyme pepsin là bước kế tiếp của tiến trình thực hiện.
Sau đó, đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố tác động đến quá trình thủy phân protein.
Với các yếu tố ảnh hưởng, tiến hành tối ưu hóa quá trình thủy phân protein trên vỏ tôm sao cho hiệu quả thủy phân đạt được là cao nhất.
2.2.4. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số kỹ thuật.
2.2.4.1. Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng protein và hàm lượng khoáng còn lại sau quá trình khử khoáng 2 giờ. còn lại sau quá trình khử khoáng 2 giờ.
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng protein và hàm lượng khoáng còn lại sau 2 giờ khử khoáng
Vỏ tôm
Khử khoáng HCl 1%, 2 giờ, nhiệt độ phòng, NL ban đầu/HCl=1/4
Kiểm tra hàm lượng protein và khoáng còn lại
2.2.4.2. Đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ sung enzyme Pepsin
a. Sơ đồ thí nghiệm.
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ sung enzyme Pepsin
b. Mô tả quy trình thực hiện
Vỏ tôm nguyên liệu: Được rã đông ở nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút.
Yêu cầu: Nguyên liệu không lẫn tạp chất, thịt hoặc đầu tôm, vỏ tôm không bị biến đen sau khi rã đông.
- Chuẩn bị mỗi thí nghiệm: Mỗi mẫu dùng 100g vỏ tôm trong bình tam giác 500ml. Thí nghiệm 1: Bổ sung 300ml nước đun cách thủy trên bếp điện 15 phút để nhiệt độ trong mẫu đạt 85-900C. Sau đó, tách bỏ dịch và làm nguội bã đến nhiệt độ phòng, sau đó bổ sung HCl 1%, tỷ lệ ¼, và khuấy đảo đều. Sau 2h xử lý với HCl tiến hành
Không bổ sung enzyme Bổ sung pepsin 10.000 UI Không bổ sung enzyme Bổ sung pepsin 10.000 UI Vỏ tôm Không xử lý nhiệt Xử lý nhiệt Khử protein(370C, 15 giờ) Kiểm tra hàm lượng protein còn lại Đảnh giá hiệu quả khử Chọn chế độ xử lý TN1 TN2 ĐC ĐC
tách dịch và điều chỉnh pH về 2, bổ sung 10.000 UI Pepsin (so với khối lượng mẫu ban đầu) để thực hiện quá trình khử protein trong 15h ở 370C. Khi kết thúc thời gian khử, tiến hành rửa sạch mẫu, phơi khô, bảo quản trong túi PE để phân tích hàm lượng khoáng và protein còn lại.
Thí ngiệm 2: Tiến hành tương tự thí nghiệm 1 nhưng không xử lý nhiệt nguyên liệu trước khi xử lý HCl.
Mẫu đối chứng không bổ sung enzyme Pepsin.
2.2.4.3. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ enzyme pepsin đến hiệu quả khử
protein và hiệu quả khử khoáng
a. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ enzyme
pepsin đến hiệu quả khử protein và hiệu quả khử khoáng
b. Mô tả quy trình thực hiện: Vỏ tôm Khử khoáng Xác định lượng protein và khoáng còn lại 5000U I 10.000U I 15.000U I 25.000UI 20.000U I 0 UI 30.000U I Khử protein bằng E.Pepsin
Chuẩn bị mỗi nồng độ 3 mẫu, mỗi mẫu cân 100g vỏ tôm trong bình tam giác 500ml, sau đó bổ sung HCl 1%, tỷ lệ ¼, và khuấy đảo đều. Sau 2h xử lý với HCl tiến hành tách dịch và điều chỉnh pH về 2
Thủy phân bằng enzyme pepsin: Các mẫu sau khi tách dịch khử khoáng được tiến hành bổ sung E.Pepsin theo các nồng độ khác nhau trong dải nghiên cứu sau đó giữở 370C trong 15 giờ.
Sau đó kiểm tra hàm lượng protein và khoáng còn lại để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ tới hiệu quả khử.
2.2.4.4. Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân bằng pepsin. phân bằng pepsin.
Tiến hành đánh giá mức độ ảnh hưởng của các nhân tố theo mô hình 2-Level Factorial với ba biến là:
Nhiệt độ thủy phân(0C): U1 =[28-40]
Nồng độ enzyme Pepsin(UI): U2 =[5000-20000]
Bảng 2.2. Ma trận bố trí thí nghiệm N Run U1(Nhi0 ệtđộ C) U2(Nồng đô UI) U3(Thời gian h) X0 X1 X2 X3 Hiệu suất khử protein (%) Hiệu quả khử khoáng (%) 1 2 28 5000 6 1 -1 -1 -1 2 1 28 5000 6 1 -1 -1 -1 3 14 40 5000 6 1 1 -1 -1 4 21 40 5000 6 1 1 -1 -1 5 17 28 20000 6 1 -1 1 -1 6 16 28 20000 6 1 -1 1 -1 7 10 40 20000 6 1 1 1 -1 8 8 40 20000 6 1 1 1 -1 9 11 28 5000 18 1 -1 -1 1 10 7 28 5000 18 1 -1 -1 1 11 19 40 5000 18 1 1 -1 1 12 22 40 5000 18 1 1 -1 1 13 13 28 20000 18 1 -1 1 1 14 3 28 20000 18 1 -1 1 1 15 5 40 20000 18 1 1 1 1 16 9 40 20000 18 1 1 1 1 17 18 34 12500 12 1 0 0 0 18 12 34 12500 12 1 0 0 0 19 6 34 12500 12 1 0 0 0 20 20 34 12500 12 1 0 0 0 21 4 34 12500 12 1 0 0 0 22 15 34 12500 12 1 0 0 0
2.2.4.5. Thí nghiệm tối ưu hóa quá trình khử protein bằng enzyme Pepsin
Mục đích của quá trình tối ưu là chọn được một chế độ công nghệ thích hợp cho quá trình loại bỏ protein từ vỏ tôm bằng enzyme Pepsin sao cho hàm lượng protein khử được là cao nhất.
Dựa vào kết quả phân tích ảnh hưởng của các yếu tố trong quá trình thủy phân ở thí nghiệm trên kết hợp với thí nghiệm thăm dò và kế thừa các kết quả nghiên cứu trước đây, miền nghiên cứu của thí nghiệm tối ưu sẽ được xác lập.
Dự kiếncác yếu tố cố định là: - pH = 2
- Tỉ lệ nước /NL = 3:1
Các thông số cần tối ưu là:
- Nhiệt độ thủy phân [28 -430C]. - Thời gian thủy phân [6-18 h].
- Nồng độ enzyme Pepsin [5.000-20.000 UI].
Hàm mục tiêu là: Hiệu quả khử protein trong quá trình thủy phân protein bằng E. Pepsin (Y (%)) Max.
Ma trận thí nghiệm thiết kế theo mô hình Box-Benken và được trình bày ở bảng 2.3
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm với biến ảo của công
đoạn khử protein bằng enzyme Pepsin.
N Run U1(nhiệt độ0C) U2(nồng độ UI) U3(Thời gian h) X0 X1 X2 X3 Hiệu suất khử protein (%) Hiệu quả khử khoáng (%) 1 9 28 5000 12 1 -1 -1 0 2 13 40 5000 12 1 1 -1 0 3 15 28 20000 12 1 -1 1 0 4 5 40 20000 12 1 1 1 0 5 3 28 12500 6 1 -1 0 -1 6 10 40 12500 6 1 1 0 -1 7 14 28 12500 18 1 -1 0 1 8 1 40 12500 18 1 1 0 1 9 7 34 5000 6 1 -1 -1 -1 10 12 34 20000 6 1 1 1 -1 11 2 34 5000 18 1 -1 -1 1 12 11 34 20000 18 1 1 1 1 13 6 34 12500 12 1 0 0 0 14 8 34 12500 12 1 0 0 0 15 4 34 12500 12 1 0 0 0
U1: nhiệt độ thủy phân (0C) U2: Thời gian thủy phân (h)
U3: nồng độ enzyme (UI)
PTHQ: Y = b0 + b1X1 +b2X2 +b3X3 +b12X12 +b13X13 +b23X23+b1’X12 + b2’X22 +b3’X32
2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA HỌC
2.3.1. Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 1050 C theo TCVN 3700-1990. 3700-1990.
2.3.2. Xác định hàm lượng khoáng bằng phương pháp nung ở 5500C theo TCVN 4588–1988. 4588–1988.
2.3.3. Xác định hàm lượng protein còn lại: Hàm lượng protein còn lại trên chitin được xác định dựa vào phương pháp đã được Gornall AG và cộng sự giới thiệu [17] được xác định dựa vào phương pháp đã được Gornall AG và cộng sự giới thiệu [17] 2.3.4. Xác định hiệu xuất khử khoáng và protein:
Hiệu suất khử protein (DP (%)) và khử khoáng (DA (%)) được xác định dựa trên
công thức của Rao và cộng sự (2000).
DP (%) = [(P0*O)-(PR*R)]*100/(P0*O)
DA (%) = [(A0*O)-(AR*R)]*100/(A0*O) Trong đó:
P0, PR: Hàm lượng protein (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý A0, AR: Hàm lượng khoáng (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý O, R: Khối lượng (g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý
2.3.5. Phương pháp xử lí số liệu:
Các số liệu được xử lý trên phần mềm Excel 2007 và DX 8.0.1 phiên bản dùng thử.
PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Hàm lượng protein và hàm lượng khoáng còn lại sau 2 giờ khử khoáng với HCl 1% Bảng 3.1. Hàm lượng protein và hàm lượng khoáng còn lại sau 2 giờ khử khoáng Bảng 3.1. Hàm lượng protein và hàm lượng khoáng còn lại sau 2 giờ khử khoáng
Thảo luận: Hiệu quả khử khoáng đạt 95,33±2,34(%), cho thấy khử khoáng có tác dụng ở những giờ đầu của công đoạn, nếu kéo dài thời gian khử khoáng thì hiệu quả có tăng lên nhưng không nhiều và HCl 1% đồng thời cũng có tác dụng khử protein hiệu quả đạt tới 35,69±3,99(%).
Giải thích: Sở dĩ HCl có tác dụng khử protein vì quá trình khử khoáng sẽ làm cho các mạch vỏ tôm được rỗng hơn tạo điều kiện thuận lợi cho protein ở dạng tự do thoát ngoài nên làm giảm protein trong vỏ tôm nguyên liệu hơn nữa hàm lượng protein còn giảm trong quá trình rửa tách dịch sau khử khoáng.
3.2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ sung enzyme Pepsin enzyme Pepsin 3.2.1. Ảnh hưởng tới hiệu quả khử protein Giá trị Hiệu quả khử protein (%) Hiệu quả khử khoáng (%) Trung bình 35.70±3.99 95.33±2.24
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ sung enzyme Pepsin đến hiệu quả khử protein.
Các chữ cái khác nhau sẽ biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê
Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nhiệt và việc bổ sung Pepsin đến hiệu quả khử protein và phụ lục 5.
Ảnh hưởng của enzyme pepsin: Enzyme pepsin có tác dụng rất tích cực đến quá trình khử protein. Khi có mặt Pepsin hiệu quả khử lên đến trên 70% trong cả hai trường hợp có và không xử lý nhiệt, tăng tương ứng gần 20% so với mẫu có nhiệt-không enzyme và 40% so với mẫu không nhiêt-không có enzyme. Kết quả này có thể là do enzyme Pepsin đã có tác dụng hỗ trợ cắt đứt liên kết giữa protein với các thành phần khác trong vỏ tôm, nhờ đó lượng protein tự do được giải phóng ra nhiều, làm tăng hiệu quả khử protein
Ảnh hưởng của nhiệt: Việc xử lý nhiệt có chỉ có tác dụng khi không bổ sung enzyme Pepsin, mẫu có nhiệt- không enzyme thì hiệu quả khử protein đạt 51,37 % cao hơn mẫu không nhiệt-không enzyme khoảng 13%, sự tăng lên này có ý
nghĩa về mặt thống kê, trong đó hai mẫu có nhiệt-có enzyme và không nhiệt-có enzyme thì hiệu quả khử này đều đạt khoảng 76%.
Việc xử lý nhiệt vỏ tôm trước thủy phân không ảnh hưởng lớn tới hiệu quả khử protein dù mẫu có bổ sung enzyme hay không.
3.2.2. Ảnh hưởng đến hiệu quả khử khoáng:
Kết quảảnh hưởng của xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ sung enzyme đến hiệu quả khử khoáng có khác với hiệu quả khử protein. Pepsin mặc dù có tác dụng làm tăng hiệu quả khử khoáng nhưng mức độ không lớn như với hiệu quả khử protein. Ở cả 2 chế độ, có bỏ sung enzyme pepsin hoặc không bổ sung enzyme pepsin thì việc xử lý nhiệt không ảnh hưởng tới hiệu quả khử protein.
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ sung enzyme Pepsin đến hiệu quả khử khoáng
Các chữ cái khác nhau sẽ biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê
Giải thích: Việc xử lý nhiệt vỏ tôm trước khi thủy phân không ảnh hưởng lớn tới hiệu quả khử khoáng có thể là do thành phần và cấu trúc của chúng: Lớp ngoài cùng của vỏ tôm có cấu trúc chitin-protein bao phủ, lớp vỏ này thường bị hóa cứng khắp bề mặt cơ thể do sự lắng đọng của muối canxi và các chất hữu cơ khác nằm dưới dạng phức tạp do sự tương tác của protein và các chất không hòa tan. Nên tại nhiệt độ 85-900C/15 phút thì nhiệt chưa đủ lớn để phá vỡ được liên kết
3.3. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ enzyme pepsin tới hiệu quả khử protein.
Hình 3.3. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của nồng độ pepsin đến hiệu quả khử
protein và khoáng
Các chữ cái khác nhau sẽ biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê
Quá trình thủy phân để khử protein của phế liệu tôm bằng enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: tỷ lệ E/S, pH, nhiệt độ, thời gian…Trong đó tỷ lệ E/S là một yếu tố quan trọng và ảnh hưởng nhiều đến tốc độ thủy phân.. Khi nồng độ enzyme càng tăng thì phản ứng thuỷ phân cắt đứt liên kết trong phân tử protein xảy ra càng mạnh. Các phân tử protein bị thuỷ phân thành polypeptid, peptid, acid amin… hoà tan vào dung dịch.
Hiệu quả khử protein: Kết quả thí nghiệm ở hình 3.3 cho thấy khi tăng tỷ lệ enzyme bổ sung vào phế liệu vỏ tôm trong khoảng từ 5000 ÷ 15.000 UI thì hiệu quả khử protein tăng tỷ lệ thuận với lượng enzyme pepsin bổ sung. Hiệu quả cao nhất đạt được ở tỷ lệ bổ sung enzyme 15.000 UI. Hiệu quả khử protein vẫn tiếp tục tăng, tại nồng độ 20.000 UI hiệu quả là 87,67% tăng 0,1% so với mẫu có nồng độ 15.000
