1.3.7.1. Tính ưu việt của enzyme protease.[19]
Enzyme là chất xúc tác cho phản ứng hóa sinh. Bản chất của enzyme là protein. Nhưng so với chất xúc tác vô cơ, enzyme có những đặc tính ưu việt hơn.
- Phản ứng thực hiện gần như có hiệu quả 100% và không kèm theo phụ phẩm thừa.
- Đồng thời có thể xảy ra nhiều phản ứng độc lập khác nhau, không bị rối bởi các sản phẩm phụ.
- Vận tốc phẩm ứng nhanh hơn, cường độ xúc tác mạnh hơn.
- Điều kiện phản ứng ôn hòa, đại đa số xảy ra ở môi trường trung tính.
- Các phản ứng chịu sự điều hòa hợp lý và tiết kiệm nhất, tiêu tốn năng lượng là tối thiểu.
- Một đặc tính rất quan trọng nữa của enzyme là trong quá trình thực hiện phản ứng nó không bị phá hủy. Khi phản ứng xúc tác kết thúc, chúng được tự do và tiếp tục xúc tác các phân tử cơ chất mới.
Chính vì vậy enzyme ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong đời sống và kỹ thuật.
Bảng 1.4. Ảnh hưởng của các thông số lên hoạt động của enzym protease và chất xúc tác vô cơ[13]
Các thông số hoạt động Enzyme Chất xúc tác vô cơ
Nhiệt độ (oC) 35-55 >100
pH Trung tính Acid, kiềm
Tính đặc hiệu Có Không
Các điều kiện nội bào Phụ thuộc chặc chẽ Không phụ thuộc Các điều kiện hoạt động của enyme ôn hòa, không quá khắc khe nhiệt độ chỉ yêu cầu 35-550C với môi trường trung tính, trong khi đó chất xúc tác vô cơ đòi hỏi tới cả 1000C tại môi trường acid hoặc kiềm.
1.3.7.2. Ứng dụng của enzyme protease. [11]
- Trong hóa phân tích : dùng để định tính và định lượng các chất.
- Trong y học : có thể dùng enzyme để chữa bệnh, sản suất các sinh tố và các chất kháng sinh. Ví dụ : có thể dùng enzyme để tăng thêm lượng enzyme cho cơ thể, chữa các bệnh thiếu enzyme bẩm sinh hoặc dùng làm các nội quan nhân tạo, dùng enzyme để chữa các bệnh tiêu hóa kém hoặc để loại bỏ các phần mô bị hỏng, bị thối ở các ổ viêm, các vết thương hoặc hòa tan các cục máu đông làm tắc nghẽn
mạch máu. Ngoài ra cũng có thể dùng enzyme để phân giải thuốc khi cơ thể bị dị ứng với thuốc.
- Trong công nghiệp :
Trong công nghiệp xà phòng dùng làm chất tẩy rửa dầu mỡ công nghiệp. Sử dụng enzyme amylase để khử hồ trên vải trong công nghiệp.
Sử dụng protease của Asp – oryzea 33 để khử lông trâu bò trong công nghiệp thuộc da, cho hiệu suất cao hơn phương pháp vôi sunfua.
Dùng enzyme thủy phân bào mòn màng cellulose để trích ly các chất keo trong rong biển.
Dùng enzyme để sản xuất bột giấy và giấy
- Ứng dụng trong thực phẩm : chế phẩm enzyme được sử dụng rất rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm.
Trong công nghiệp chế biến thịt: Protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân protein trong thịt.
Trong chế biến thủy sản: Chế biến nước mắm ngắn ngày rút ngắn thời gian chế biến và nâng cao hiệu quả kinh tế.
Trong công nghiệp sữa: protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ tác dụng làm đông tụ sữa.
Trong sản xuất bánh mì, bánh quy protease làm giảm thời gian nhào trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và độ nở tốt hơn.
Trong sản xuất nước giải khát: làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Làm trong và ổn định nước quả, rượu vang.
- Trong nông nghiệp:
Có thể dùng enzyme sản xuất thức ăn cho động vật nhằm tăng giá trị dinh dưỡng cho thức ăn thô, tăng hệ số sử dụng thức ăn. Các enzyme được sử dụng với mục đích này thường là các enzyme thủy phân như amylase, protease, đặc biệt là cellulose, hemicellulose. Chúng thủy phân các phân tử lớn thành dạng dễ hấp thụ hơn nên thường làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn lên khoảng 10%, tăng trọng gia súc trung bình 10-15%.
- Ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm từ phế liệu thủy sản.
Ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm từ phế liệu tôm, cua, ghẹ... Việc kết hợp sử dụng enzyme protease trong quá trình sản xuất chitin-chitosan có ưu thế hơn so với phương pháp hóa học truyền thống. Nó giảm thiểu lượng hóa chất sử dụng và thải ra môi trường. Mặt khác, quy trình cải tiến với sự vượt trội về chất lượng chitin, chitosan thu được và thu hồi sản phẩm protein-astaxanthin có giá trị dinh dưỡng và sinh học, làm hạn chế các chất hữu cơ chứa trong nước thải, giảm thiểu chi phí xử lý môi trường. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường trầm trọng do các cơ sở chế biến chitin-chitosan gây ra, góp phần phát triển bền vững ngành công nghiệp sản xuất chitin-chitosan từ phế liệu thủy sản. Đây là một hướng đi cho phương pháp sản xuất sạch hơn. Bên cạnh đó, việc kết hợp sinh học và hóa học còn đảm bảo vấn đề giá thành sản xuất hợp lý, cơ hội cho mở rộng sản xuất với quy mô lớn. Chitin-chitosan thu được có chất lượng cao hơn so với phương pháp hóa học, đặc biệt là độ nhớt và phân tử lượng. Đồng thời, giảm hơn 50% lượng hóa chất sử dụng so với phương pháp hóa học truyền thống. [3]
1.4. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHITIN
Cho đến nay trên thế giới đã có nhiều quy trình sản xuất chitin-chitosan, với nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau nhưng chủ yếu là vỏ tôm, cua, ghẹ…Những nước đã thành công trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitin-chitosan đó là: Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp. Sau đây là một số nghiên cứu tiêu biểu:
1.4.1. Quy trình của Đỗ Minh Phụng, Trường Đại Học Thủy Sản.
Nhận xét: Chitin thu được có độ trắng cao mặc dù không có công đoạn tẩy màu. Tuy nhiên, lại có nhược điểm là thời gian sản xuất kéo dài, tiêu tốn nhân công, nồng độ hóa chất sử dụng cao kết hợp với thời gian xử lý dài (công đoạn khử khoáng) làm cắt mạch polymer trong môi trường acid dẫn đến độ nhớt giảm.
Hình 1.4. Quy trình của Đỗ Minh Phụng, Trường Đại Học Thủy Sản HCl 6 N T0 phòng T =48h w/v = 1/2,5 NaOH 8% T0 =1000C T = 2h w/v = 1/2,5 NaOH 40% T0 =240C T = 24h w/v = 1/1 Vỏ tôm khô Rửa trung tính Ngâm HCl Ngâm NaOH Rửa trung tính Tấy màu Chitin Nấu trong NaOH Rửa trung tính Chitosan
1.4.2. Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm sú bằng phương pháp hóa học với một công đoạn xử lý kiềm ( Trần Thị Luyến) một công đoạn xử lý kiềm ( Trần Thị Luyến)
Hình 1.5. Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm sú bằng phương pháp hóa học với một công đoạn xử lý kiềm ( Trần Thị Luyến, 2003).
Bảng 1.5. Một số chỉ tiêu chất lượng của chitosan từ vỏ tôm sú theo phương
pháp sử lý kiềm một giai đoạn (Trần Thị Luyến, 2003).
STT Chỉ tiêu Kết quả STT Chỉ tiêu Kết quả 1 Màu sắc Trắng đẹp 7 Độ deacetyl 76,25% 2 Trạng thái Mềm mại 8 Tổng thời gian thực hiện 9,5 giờ 3 Độẩm 10% 9 Nts 8,07 % 4 Hàm lượng tro 0,023 % 10 Hiệu suất 40,25% 5 Hàm lượng các chất không tan 1,6 % 11 Độ tan 98,32% 6 Độ nhớt 14,480E 12 Phản ứng Bỉure Âm tính HCl 10% T0 phòng t = 5h w/v = 1/5 HCl 10% T0 phòng t = 5h w/v = 1/10 NaOH 40% T0= 80 ±20C T = 5h w/v=1/10
Vỏ tôm khô Vỏ tôm tươi
Ngâm HCl Rửa trung tính Rửa trung tính Chitosan Ngâm HCl Khử protein, lipid
1.4.3. Quy trình của Trung Tâm Chế Biến Đại Học Thủy Sản
Quy trình của Trung Tâm Chế Biến có ưu điểm là đơn giản, không đòi hỏi máy móc thiết bị phức tạp. Do đó, rất dễ dàng để sản xuất lớn. Tuy nhiên thời gian sản xuất kéo dài và nồng độ hóa chất sử dụng còn khá cao, vẫn chưa có hướng xử lý nước thải từ quá trình sản xuất
Hình 1.6. Quy trình của Trung Tâm Chế Biến Đại Học Thủy Sản HCl 7% T0 phòng t =24h w/v=1/5 NaOH 6% T0 phòng T = 24h w/v = 1/5 NaOH 40% T0 = 800C T =6,5h w/v = 1/10 Phơi, sấy Phế liệu tôm Rửa sơ bộ Khử khoáng Ngâm rửa trung tính Khử protein Rửa trung tính Deacetyl hóa Ngâm rửa trung tính Chitosan
1.4.3. Quy trình sử dụng enzyme Papain để sản xuất chitosan ( Trần Thị Luyến, 2003)
Hình 1.7. Quy trình sử dụng Emzyme papain để sản xuất chitosan ( Trần Thị Luyến, 2003) HCl 10% T0 phòng T =5h w/v =1/10 HCl 10% T0 phòng T =5h w/v =1/10
Vỏ tôm khô Vỏ tôm tươi
Ngâm HCl Ngâm HCl Rửa trung tính Khử protein Rửa sạch Làm khô Deacetyl Rửa trung tính Chitosan Chitin
Bảng 1.6. Một số chỉ tiêu chất lượng của chitosan từ quy trình sử dụng
Emzyme papain để sản xuất Chitosan (Trần Thị Luyến, 2003).
Chỉ tiêu Kết quả Chỉ tiêu Kết quả Màu sắc Trắng trong Độ nhớt 15,25 Trạng thái Mềm mại Độ deacety 78,25 Độẩm 10,10% Nts 8,25 Hàm lượng tro 0,68% Hiệu suất 41,25 Hàm lượng các chất
không tan 0.92% Độ tan 98,36
1.4.4. Quy trình sản xuất chitin của Holan da và Netto
Hình 1.8. Quy trình sản xuất chitin của Holan da và Netto pH = 8,5 t0 = 550C
tỷ lệ E/NL = 3% w/v = 1/1
Khử protein bằng enzyme Alcalase
Phế liệu tôm
Chiết Astaxanthin bằng dầu
nành và hỗn hợp dung môi
Phần bã
Ly tâm (40C, 15 phút)
Rửa trung tính
Khử khoáng HCl 2,5 %,2h,t0
phòng
Chitin
Sấy khô (600C, 16h)
Bột protein
Sấy lạnh
Phần dịch nổi phía trên
Ngoài ra, còn có rất nhiều các nghiên cứu sản xuất chitin bằng phương pháp sinh học khác trên thế giới cũng như tại Việt Nam như:
Gagne và Simpson (1993) đầu tư ứng dụng chymotrypsin và papain để khử protein của phế liệu tôm. Nghiên cứu chỉ ra protein còn lại trong phế liệu sau khi thủy phân là 1,3 % khi xử lý bằng chymotrypsin và 2,8% với papain.
Theo Jen-Kuo Yang và cộng sự (1999) sử dụng protease từ Bacillus subtilis ở nhiệt độ 500C, pH 8,0 để khử protein từ vỏ tôm, vỏ ghẹ, vỏ tôm hùm trong công nghệ sản xuất chitosan. Kết quả đã loại bỏ được 88%, 67%, 83% protein theo thứ tự.
Synowiecki và cộng sự (2002) nghiên cứu ứng dụng Alcalase để khử protein của phế liệu vỏ tôm Crangon cragon nhằm thu hồi chitin và protein. Ban đầu vỏ tôm Crangon cragon được khử khoáng sơ bộ bằng dung dịch HCl 10% ở 200C trong 30 phút và khử protein bởi enzyme thương mại Alcalase ở 550C và pH 8,5. Dịch thủy phân thu được chứa 63% protein so với vật chất khô (Nx6,25). Hàm lượng protein còn lại sau thủy phân khoảng 4% có thể do trong quá trình thủy phân có sự kết hợp khử protein bằng NaOH 4M.
Holanda và Netto, (2006), nghiên cứu thu hồi 3 thành phần chính của phế liệu tôm, protein, chitin, astaxanthin bằng việc sử dụng enzyme Alcalase và pacreatin. Theo tác giả trong phế liệu tôm Xiphopenaeus kroyeri có chứa 39,42% protein; 31,98% tro; và 19,92% chitin. Tiến hành thủy phân khử protein bằng enzyme Alcalase tại các điều kiện: tỷ lệ enzyme/nguyên liệu 3%, nhiệt độ 600C, pH 8,5. Kết quả cho thấy rằng Alcalase có hiệu quả thu hồi protein, astaxanthin, chitin cao hơn so với trypsin, chimotripsin và carboxypeptidase tăng hiệu quả thu hồi protein từ 57,5% lên 64,6% và astaxanthin từ 4,7 lên 5,7mg/100g phế liệu khô.
Rao và Stevens (2005) đã sản xuất Chitin bằng cách ủ xi lô đầu và vỏ tôm với Lactobacillus plantarum 541. Hiệu suất thu hồi Chitin từ đầu và vỏ tôm là 4,5% và 13% với đầu tôm đã khử được 83% protein và 88% khoáng, khử được 66% protein và 63% khoáng từ vỏ tôm.
Gần đây Trường đại học Nha Trang đã đi sâu nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất ở bước cao hơn theo hướng giảm thiểu sử dụng hóa chất trong xử lý,
ứng dụng công nghệ enzyme và có nhiều kết quả được công bố đã góp phần đáp ứng yêu cầu cấp bách xử lý phế liệu tôm đông lạnh và trước những yêu cầu khắt khe hơn về chất lượng chitin - chitosan trên thị trường.
Trần Thị Luyến và Đỗ Thị Bích Thủy (2006) nghiên cứu nuôi cấy trực tiếp vi khuẩn Bacillussubtilis để loại bỏ protein ra khỏi vỏ của phế liệu tôm. Sau 24h phần trăm protein còn lại trong phế liệu tôm so với mẫu chưa xử lý là 12,99%.
PHẦN 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Nguyên liệu vỏ tôm 2.1.1. Nguyên liệu vỏ tôm
Vỏ tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) được chọn là đối tượng nghiên cứu. Vỏ được lấy từ nguyên liệu tôm Thẻ chân trắng chế biến tại Công ty Cổ Phần Nha Trang Seafoods (F17), Khánh Hòa.
2.1.2. Enzyme Protease[16]
- Enzyme Pepsin: Enzyme Pepsin của Merck được chiết từ niêm mạc dạ dày lợn có pH trong khoảng từ 1,5 đến 4.
2.1.3. Hóa chất sử dụng.
Tất cả các hóa chất sử dụng trong đề tài đều ở dạng tinh khiết dùng cho phân tích.
2.1.4 Thiết bị:
Bảng 2.1. Một số thiết bị thí nghiệm
Tên thiết bị Bểổn nhiệt Máy vortex Thiết bị đo UV vis
Model Memmert WNB 29
(L1), 29 lít ZX3 UVmini-1240
Hãng sản xuất Memmert - Đức VELP- Italy
Công ty (Nhà máy) và nước sản xuất: Shimazu,
Nhật
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp thu nhận mẫu
Nguyên liệu vỏ tôm được thu từ phân xưởng chế biến, Công Ty Cổ Phần Nha Trang Seafoods (F17). Yêu cầu nguyên liệu phải còn tươi, không có mùi lạ, không bị biến đỏ, không lẫn tạp chất. Nguyên liệu sau khi lấy cho ngay vào thùng xốp cách nhiệt có chứa nước đá và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm. Nguyên liệu được loại bỏ tạp chất, ép sơ bộ để tách nước và tiến hành làm thí nghiệm. Trong trường hợp chưa làm ngay thì nguyên liệu được cho vào túi polymer (mỗi túi 1kg), và bảo quản đông ở nhiệt độ -200C. Thời gian bảo quản 1 tháng.
2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm.
- Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ sung enzyme tới khả năng khử protein của enzyme Pepsin bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
- Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ Pepsin đến hiệu quả
khử khoáng và khử protein bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
- Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố và tối ưu quá trình thủy phân protein với enzyme pepsin bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
2.2.3. Bố trí thí nghiệm tổng quát.
a. Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Tỉ lệ E/NL: [5000-20000] Nhiệt độ: [28-430C] Thời gian: [6÷18]
Vỏ tôm
Tối ưu hóa quá trình khử protein bằng E.Pepsin
Chitin
Đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến hiệu quả
khử protein của enzyme pepsin
Xác định hàm lượng protein và hàm
lượng khoáng sau 2 giờ khử khoáng
Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ Pepsin đến hiệu quả khử khoáng và
Nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố đến hoạt động của enzyme pepsin
Tỉ lệ E/NL: [5000-20000] Nhiệt độ: [28-430C] Thời gian: [6÷18]
b. Thuyết minh quy trình:
Nguyên liệu vỏ tôm được đưa vào thí nghiệm đảm bảo còn tươi, không bị biến đen, biến đỏ hay có mùi lạ, không lẫn tạp chất.
Trước khi thủy phân, tiến hành xác định hàm lượng protein và hàm lượng khoáng còn lại sau quá trình khử khoáng để làm cơ sở cho các công đoạn sau.
Tiếp theo, nguyên liệu được đánh giá ảnh hưởng của nhiệt đến khảnăng thủy phân protein bằng cách xử lý nguyên liệu ở 90oC trong 15 phút, đồng thời kết hợp đánh giá ảnh hưởng của enzyme đến khả năng thủy phân protein bằng cách bổ sung enzyme pepsin 10.000 UI.
Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ enzyme pepsin đến hiệu quả khử protein và hiệu quả khử khoáng của enzyme pepsin là bước kế tiếp của tiến trình thực hiện.
Sau đó, đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố tác động đến quá trình thủy phân protein.
Với các yếu tố ảnh hưởng, tiến hành tối ưu hóa quá trình thủy phân protein trên vỏ tôm sao cho hiệu quả thủy phân đạt được là cao nhất.
2.2.4. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số kỹ thuật.
2.2.4.1. Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng protein và hàm lượng khoáng còn lại sau quá trình khử khoáng 2 giờ. còn lại sau quá trình khử khoáng 2 giờ.
