CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5 Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Đánh giá nguyên liệu lêkima tươi
Lêkima được thu mua trực tiếp tại huyện Phong Điền, Thành Phố Cần Thơ. Chọn lêkima chín mềm, màu vàng tươi hay vàng cam, có mùi thơm đặc trưng, nên chọn quả bầu nhọn vì chúng ít hạt hơn loại tròn to. Nguyên liệu mua về được để chín tự nhiên từ 3 đến 6 ngày, thường xuyên theo dõi đến khi chín đồng loạt, loại bỏ những quả chưa chín hoặc chín sớm. Sau đó loại bỏ vỏ, hạt, tách thịt quả và tiến hành chế biến.
3.5.1.2 Đánh giá nguyên liệu lêkima tươi [24-27]
Khảo sát hàm lượng nước, tro toàn phần, lipid tổng, đường tổng số, vitamin C và định tính β-carotene trong nguyên liệu.
a) Hàm lượng nước
Nguyên tắc
Dùng sức nóng làm bay hơi hết nước trong lêkima. Cân trọng lượng trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra được phần trăm nước có trong lêkima tươi.
Hình 3.1: Quả lêkima bầu nhọn Hình 3.2: Quả lêkima tròn to
Cách tiến hành
Sấy cốc sứ ở 105ºC trong 1 giờ đến khối lượng không đổi, làm nguội trong bình hút ẩm và cân.
Cho 2 g nguyên liệu lêkima tươi vào cốc sứ.
Sấy lêkima tươi ở 105°C trong 3 giờ đến khối lượng không đổi, làm nguội trong bình hút ẩm và cân.
Cách tính kết quả
Hàm lượng nước (W) của lêkima tươi được tính theo công thức:
𝑊 (%) = 𝑚1− 𝑚2
𝑚1− 𝑚𝑜× 100 Trong đó:
mo là khối lượng cốc sứ sau khi sấy 1 giờ, (g).
m1 là khối lượng cốc sứ và nguyên liệu lêkima tươi, (g).
m2 là khối lượng cốc sứ và lêkima tươi sau khi sấy 3 giờ, (g).
b) Tro toàn phần
Nguyên tắc
Dùng sức nóng (≤ 600°C) đốt cháy hoàn toàn các chất hữu cơ. Phần còn lại đem cân và tính ra phần trăm tro có trong lêkima tươi.
Cách tiến hành
Nung cốc sứ ở 600ºC trong 1 giờ, làm nguội trong bình hút ẩm và cân.
Cho vào cốc sứ 2 g lêkima tươi.
Đun cốc sứ trên bếp điện đến khi không còn bốc khói. Sau đó, cho vào lò nung, nung ở 600ºC trong 5 giờ đến khi thành tro màu trắng, làm nguội trong bình hút ẩm và cân.
Cách tính kết quả
Tro toàn phần (G) được tính theo công thức:
𝐺(%) = (𝑏 − 𝑎)
𝑃(100 − 𝐻)× 10000 Trong đó:
b là khối lượng cốc sứ và lêkima tươi, (g).
a là khối lượng cốc sứ, (g).
P là khối lượng lêkima tươi, (g).
H là độ ẩm nguyên liệu lêkima tươi, (%).
c) Xác định hàm lượng lipid tổng theo phương pháp Soxhlet
Nguyên tắc
Dùng dung môi kỵ nước trích ly hoàn toàn lipid từ nguyên liệu đã được nghiền nhỏ. Một số thành phần hòa tan trong chất béo cũng được trích ly theo bao gồm sắc tố, các vitamin tan trong chất béo, các chất mùi,… tuy nhiên hàm lượng của chúng thấp. Do có lẫn tạp chất, phần trích ly được gọi là lipid tổng hay dầu thô.
Có 2 phương pháp xác định:
Phương pháp trực tiếp: trích lipid ra khỏi nguyên liệu và cân lượng lipid được trích ly.
Phương pháp gián tiếp: xác định chênh lệch khối lượng nguyên liệu khô trước và sau khi chiết xuất lipid ra khỏi nguyên liệu, từ đó suy ra khối lượng lipid trong mẫu phân tích.
Cách tiến hành
Làm khô mẫu: mẫu được sấy khô đến khối lượng không đổi.
Xác định khối lượng bao giấy: bao giấy gói mẫu được làm từ giấy lọc không chứa mỡ sao cho mẫu không lọt ra ngoài và được tiếp xúc nhiều với dung môi. Sấy bao giấy, tốt nhất là cùng lúc với sấy mẫu phân tích, ở nhiệt độ 100-105ºC trong 2-3 giờ, để nguội 30 phút trong bình hút ẩm, cân. Lặp lại đến khi có khối lượng không đổi.
Chiết xuất: cân 10 g mẫu khô cho nhẹ nhàng vào bao giấy sao cho không rơi ra ngoài, dàn đều và gói lại cẩn thận. Cho toàn bộ bao giấy chứa mẫu vào bộ chiết xuất của máy chiết sohxlet và đậy lại. Đợi mẫu ngấm đều giữa bình cầu và bộ chiết 5-10 vòng/giờ.
Xác định khối lượng: sau khi kết thúc quá trình chiết xuất (nhận biết bằng cách nhỏ 1 giọt dung môi dầu dưới bộ phận chiết lên mặt kính động hồ và không còn vết sau khi dung môi bay hơi), lấy bao giấy ra, đợi bay hơi hết dung môi, sấy ở nhiệt độ 105ºC 2-3 giờ, làm nguội trong bình hút ẩm 30 phút và cân. Lặp lại các bước sấy và cân đến khối lượng không đổi.
Cách tính kết quả
Hàm lượng lipid (X) được tính theo công thức sau:
𝑋 (%) = 𝑀1− 𝑀2
𝑚 × 100 Trong đó:
M1 là khối lượng mẫu và bao giấy trước khi chiết xuất, (g).
M2 là khối lượng mẫu và bao giấy sau khi chiết xuất, (g).
m là khối lượng mẫu, (g).
d) Xác định đường tổng số bằng phương pháp Bertrand
Nguyên tắc
Trong môi trường kiềm các đường khử (glucose, fructose, maltose...) dễ dàng khử đồng (II) thành đồng (I) theo phản ứng Fehling. Kết tủa đồng (I) oxide có màu đỏ gạch, có khả năng khử với muối Fe3+ thành muối Fe2+ trong môi trường acid:
Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4 2CuSO4 + H2O + 2FeSO4
Fe2+ sinh ra có tính khử lại tác dụng với KMnO4 là chất oxy hóa nên dùng KMnO4 để chuẩn độ Fe2+ trong môi trường acid:
10FeSO4 + 8H2SO4 + 2KMnO4 K2SO4 + 2MnSO4 + 5Fe2(SO4)3 + 8H2O Dựa vào lượng KMnO4 sử dụng ta có thể tính được lượng Cu2O và từ đó tính được lượng đường khử trong dung dịch bằng cách tra bảng tỉ lệ giữa dung dịch KMnO4 và đường nghịch chuyển của Bertrand.
Cách tiến hành
Chuẩn bị mẫu thử: cân và cho vào cối sứ 10 g lêkima tươi, nghiền nhỏ, thêm khoảng 50 mL nước cất vào bình tam giác 250 mL. Đem đun cách thủy ở 80°C trong 15 phút, thỉnh thoảng lắc đều trong khi đun để chiết tách đường. Sau đó lấy ra, để nguội đến nhiệt độ phòng.
Tiến hành khử tạp chất
Thêm 7 mL dung dịch chì acetate 30% vào dịch chiết đường và cho vào bình định mức 100 mL, lắc đều và để lắng 5 phút. Nếu thấy xuất hiện một lớp chất lỏng trong suốt ở bên trên lớp cặn thì việc khử tạp chất đã xong.
Cho tiếp 20 mL dung dịch Na2SO4 bão hoà vào để loại chì thừa. Lắc đều và để tủa lắng xuống. Thêm nước cất vừa đủ đến vạch 100 mL, lắc đều và lọc qua giấy lọc khô. Dịch lọc dùng để tiến hành định lượng.
Tiến hành định lượng
Cho 10 mL dung dịch đường cần khảo sát và 10 mL thuốc thử Fehling A với 10 mL Fehling B vào bình tam giác 250 mL. Đậy bình bằng nút thủy tinh và đun trên bếp có lưới amiăng. Đun sôi khoảng 3 phút, kết tủa đỏ xuất hịên trong bình. Lấy bình ra để nguội.
Rửa kết tủa vài lần với nước ấm đã đun sôi cho đến khi dịch rửa không còn phản ứng kiềm trên giấy quỳ. Quá trình rửa được tiến hành trên phễu lọc chân không với giấy lọc xốp G4. Chú ý là phần lớn kết tủa trên phễu lọc và trong bình luôn được phủ một lớp nước để Cu2O không bị oxy hóa bởi oxy không khí.
Hòa tan kết tủa Cu2O vào bình tam giác bằng cách cho từ từ khoảng 5 mL dung dịch Fe2(SO4)3 trong H2SO4 và dùng đũa thủy tinh khuấy thật cẩn thận để hòa tan hoàn tòan kết tủa trên phễu. Tráng cẩn thận bình và phễu lọc 3-4 lần bằng nước nóng cho vào bình tam giác 100 mL.
Chuẩn độ dung dịch thu được bằng KMnO4 0,1 N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 20-30 giây. Từ lượng KMnO4 0,1 N dùng để chuẩn độ, tra bảng 3.1 để suy ra lượng đường có trong mẫu phân tích.
Cách tính kết quả
Hàm lượng đường tổng (Y) tính theo công thức:
𝑌(%) = 𝑎 × 𝑉 × 100
𝑉1 ×𝑚 ×1000
Trong đó:
a là số mg glucose tìm được khi tra bảng ứng với số mL KMnO4
0,1 N dùng để chuẩn độ mẫu phân tích, (mg).
V là thể tích pha loãng mẫu, (mL).
V1 là thể tích mẫu lấy đem xác định đường khử, (mL).
m là lượng mẫu đem phân tích, (g).
1000 là hệ số đổi gam thành mg.
Bảng 3.1: Xác định lượng đường nghịch chuyển
KMnO4
0,1 N (mL)
Đường nghịch chuyển (mg)
KMnO4
0,1 N (mL)
Đường nghịch chuyển (mg)
KMnO4
0,1 N (mL)
Đường nghịch chuyển (mg)
KMnO4
0,1 N (mL)
Đường nghịch chuyển (mg)
3,24 10 9,33 30 15,0 50 20,3 70
3,55 11 9,64 31 15,2 51 20,5 71
3,87 12 9,94 32 15,5 52 20,8 72
4,17 13 10,1 33 15,8 53 21,1 73
4,49 14 10,4 34 16,1 54 21,3 74
4,80 15 10,7 35 16,4 55 21,6 75
5,12 16 11,0 36 16,6 56 21,8 76
5,43 17 11,3 37 16,9 57 22,1 77
5,73 18 11,6 38 17,2 58 22,4 78
6,05 19 11,9 39 17,4 59 22,6 79
6,36 20 12,2 40 17,7 60 22,9 80
6,67 21 12,5 41 18,0 61 23,2 81
6,95 22 12,7 42 18,2 62 23,4 82
7,27 23 13,0 43 18,5 63 23.7 83
7,57 24 13,3 44 18,8 64 23,9 84
7,84 25 13,6 45 19,0 65 24,1 85
8,14 26 13,9 46 19,3 66 24,3 86
8,43 27 14,1 47 19,5 67 24,6 87
8,74 28 14,4 48 19,8 68 24,8 88
9,03 29 14,7 49 20,1 69 25,1 89
e) Xác định hàm lượng vitamin C theo phương pháp Muri
Nguyên tắc
Acid ascorbic sẽ khử chất chỉ thị màu 2,6-Dichlorophenolindophenol (DICP) có màu xanh thành một dung dịch không màu. Ở điểm cân bằng tất cả acid ascorbic thì chất chỉ thị màu dư thừa không bị khử có màu hồng trong dung dịch aicd.
Cách tiến hành
Chuẩn bị mẫu: cân 10 g thịt lêkima tươi được cắt nhỏ, cho vào cối sứ cùng với 20 mL HCl 1%, ngâm khoảng 10 phút. Dịch ngâm sau khi lọc ra được giữ lại trong cốc, phần thịt được nghiền mịn, chuyển sang bình định mức 100 mL cùng với dung dịch HCl 1% vừa chiết ra. Cối và dụng cụ được tráng 3 lần với một ít acid oxalic 1%, tất cả được cho vào bình định mức. Thêm acid oxalic đến vạch, lắc kỹ. Sau đó để yên 15 phút rồi lọc qua giấy lọc.
Chuẩn độ mẫu đối chứng: hỗn hợp 8 mL acid oxalic 1% và 2 mL HCl 1%
được cho vào bình tam giác dung tích 100 mL. Sau đó chuẩn độ với DICP đến lúc xuất hiện màu hồng bền trong 1 phút. Lặp lại thí nghiệm 3 lần.
Chuẩn độ mẫu lêkima tươi: lấy chính xác 10 mL dịch lọc chứa vitamin C cho vào bình tam giác dung tích 100 mL, tiến hành chuẩn độ như mẫu đối chứng.
Cách tính kết quả
Hàm lượng vitamin C (V) trong 100 g lêkima tươi được tính như sau:
(𝑉 %) =(𝑎 − 𝑏) × 0,0088 × 𝑉 × 100
× 𝑚
Trong đó:
a: số mL DICP trung bình khi định chuẩn lêkima tươi, (mL) b: số mL DICP trung bình khi định chuẩn mẫu đối chứng, (mL).
V: thể tích dịch chiết ban đầu, (mL).
: thể tích dịch chiết lấy để định chuẩn, (mL).
m: khối lượng lêkima ban đầu, (g).
0,0088: số mg acid ascorbic tương đương với 1 mL dung dịch chuẩn DICP.
f) Bán định lượng kim loại nặng (chì) bằng phương pháp so màu
Nguyên tắc
Dùng dung dịch chì chuẩn 10 ppm tạo phức màu với thuốc thử dithizone, so sánh với màu mẫu cao chiết chuẩn bị trong cùng điều kiện.
Cách tiến hành Chuẩn bị dung dịch thử :
Trộn đều 3 g lêkima tươi với 0,5 g magnesium oxide trong một cốc sứ.
Nung đỏ hỗn hợp trên bếp điện cho đến khi thu được một khối đồng nhất màu xám nhạt, sau đó nung trong lò nung ở 800°C trong 1 giờ.
Hòa tan cắn bằng 10 mL dung dịch acid hydrochloric 5 N, sau đó thêm 0,1 mL phenolphthalein, rồi cho dung dịch ammoniac đậm đặc đến khi có màu hồng.
Để nguội, cho acid acetic băng đến khi mất màu dung dịch, rồi thêm 0,5 mL nữa. Lọc, rồi pha loãng dung dịch với nước thành 20 mL. Lấy 12 mL dung dịch thu được ở trên cho vào một ống nghiệm.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn: lấy 2 mL dung dịch chì mẫu 10 ppm, cho vào một chén nung silica, trộn với 0,5 g magnesium oxide. Làm khô hỗn hợp trong tủ sấy ở 100-105°C. Sau đó, đun trên bếp điện, các giai đoạn sau tiến hành tương tự như chuẩn bị dung dịch thử.
So màu
Thêm 1,2 mL dung dịch dithizone vào dung dịch thử và dung dịch chuẩn, lắc đều rồi để yên 2 phút. So màu ống chuẩn chứa dung dịch chì 10 ppm với ống nghiệm chứa dung dịch chế phẩm thử.
g) Định tính β-carotene bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
Nguyên tắc
Dựa vào tính hòa tan của β-carotene trong dung môi hữu cơ như acetone.
Mẫu được ngâm trong dung dịch acetone qua đêm (để hạn chế sự tiếp xúc của carotene với ánh sáng và sự oxy hóa) hoặc cho vào máy lắc, lắc liên tục trong vòng 2 giờ. Lọc dung dịch qua phễu được ngăn bằng lớp sodium sulfate khan và rửa lại mẫu qua dung dịch acetone cho đến khi dịch lọc không màu.
Cách tiến hành
Cân 10 g lêkima tươi cho vào bình tam giác 250 mL, thêm vào 100 mL acetone, đậy nút kín. Cho vào máy lắc, lắc liên tục trong 2 giờ hoặc để qua đêm.
Lọc dịch qua phễu được ngăn bằng lớp Na2SO4 khan. Đảm bảo mẫu luôn luôn giữ một lớp dung môi dày 1-2 cm để tránh β-carotene bị oxy hóa. Tiến hành rửa bằng acetone cho đến khi dịch chiết không màu thì ngưng. Sau đó, loại bỏ dung môi acetone bằng cách cô quay dịch chiết đến cắn, hòa tan cắn với 5 mL chloroform.
Để định tính β-carotene trong lêkima tươi tiến hành chấm sắc ký lớp mỏng, với hệ dung môi giải ly là cyclohexane:ether dầu hỏa = 4:1