CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5 Phương pháp nghiên cứu
3.5.3 Đánh giá chất lượng sản phẩm bột dinh dưỡng lêkima
Các chỉ tiêu đánh giá hàm lượng protein, các vitamin và khoáng chất, kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn và kiểm tra hàm lượng kim loại nặng được thực hiện cùng với các anh chị phòng Kiểm nghiệm Công ty Cổ phần Dược Hậu Giang.
3.5.3.1 Độ ẩm
Độ ẩm của sản phẩm bột dinh dưỡng lêkima được đo bằng máy sấy ẩm hồng ngoại Mettler Toledo. Mỗi lần đo khoảng 3,5-4 g bột lêkima. Lặp lại kết quả đo 3 lần, lấy giá trị trung bình.
3.5.3.2 Xác định hàm lượng xơ thô
Nguyên tắc
Chất xơ là phần còn lại sau khi sử lý mẫu với dung dịch H2SO4 1,25% và NaOH 1,25% trong điều kiện đặc biệt.
Cách thực hiện
Cân 1 g bột lêkima cho vào becher 250 mL. Thêm 150 mL H2SO4 vào, đun sôi trong 10 phút, để nguội rồi lọc qua giấy lọc đã biết trước khối lượng.
Rửa phần cắn bằng 150 mL NaOH, đun sôi trong 10 phút, để nguội rồi lọc qua giấy lọc đã biết trước khối lượng.
Rửa cắn nhiều lần bằng nước cất cho hết NaOH, sau đó rửa bằng acetone 3 lần, mỗi lần 10 mL. Kiểm tra đã hết NaOH bằng cách tiếp xúc với giọt nước đọng ở đáy phễu không còn độ nhớt là được.
Cho giấy lọc có mẫu đã xử lý vào cốc sứ, sấy ở 105oC trong 3 giờ. Đặt vào bình hút ẩm, đem cân, có khối lượng P1.
Đặt cốc sứ và mẫu sau khi xử lý vào lò nung, điều chỉnh nhiệt độ 600oC trong vòng 4 giờ (đến khi tro có màu trắng). Lấy ra cho vào bình hút ẩm, đem cân, có khối lượng P2.
Cách tính kết quả
Hàm lượng xơ thô (P) trong 100 g bột lêkima được tính như sau:
𝑃 (%) = 𝑃1 − 𝑃2
𝑊 × 100 Trong đó:
P1: khối lượng cốc sứ và mẫu sau khi sấy, (g).
P2: khối lượng cốc sứ và mẫu sau khi nung, (g).
3.5.3.3 Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl
Nguyên tắc
Vô cơ hóa thực phẩm bằng H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác. Dùng kiềm mạnh NaOH đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 hình thành ra thể tự do. Định lượng NH3 tự do bằng một acid.
Cách tiến hành Sự vô cơ hóa
Cân chính xác 2 g bột lêkima, cho vào bình Kjeldahl có thể tích 100 mL, sau đó thêm 5 mL H2SO4 đậm đặc và khoảng 2 g hỗn hợp chất xúc tác gồm K2SO4: CuSO4: Se (100:10:1).
Sau khi cho chất xúc tác vào bình, đem đun sôi trong máy vô cơ hóa Gerhardt đã được nối với hệ thống hấp thu khí độc cho đến khi dung dịch trong bình Kjeldahl trong suốt. Để nguội, ta kiểm tra kết thúc sự vô cơ hóa bằng cách cho vào bình một lượng nhỏ nước cất (thường bằng bình tia) rồi lắc nhẹ tráng thành bình, thấy không còn những hạt mụi đen li ti là được. Nếu còn ta phải đun tiếp tục cho đến hết.
Cất đạm
Sau khi vô cơ hóa kết thúc, mẫu được đem cất đạm trong máy cất bán tự động Gerhardt. Chuẩn bị máy: cắm điện, bật máy, màn hình sẽ hiện lên chữ
“H”, mở vòi nước làm lạnh, chờ đến khi màn hình hiện chữ “P”, máy đã sẵn sàng làm việc.
Cho 20 mL acid boric 2% vào bình tam giác 100 mL, thêm 2 giọt thuốc thử (dung dịch bromocresol green và methyl red trong alcol), lắp vào vị trí hứng mẫu trên máy. Chú ý nhúng ngập ống vào dung dịch.
Lắp ống Kjeldahl chứa mẫu đã vô cơ hóa vào hệ thống.
Chuẩn độ
Lấy bình tam giác ra khỏi máy sau khi đã tráng nước cất để lấy hết mẫu bám trên ống. Chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0,1 N cho đến khi dung dịch chuyển từ màu xanh lá sang màu hồng nhạt. Đọc thể tích trên buret.
Cách tính kết quả
Hàm lượng nitơ tổng số (gam) có trong 100 gam mẫu được tính theo công thức sau:
𝑁 (%) = 0,0014 × 𝑁 × 100 𝑚
Trong đó:
0,0014 là số gam nitơ tương ứng với 1 mL H2SO4 0,1 N N là số mL H2SO4 dùng chuẩn độ, (mL)
m là khối lượng mẫu đem phân tích (g).
Hàm lượng protein thô được xác định gián tiếp thông qua nitơ tổng số và hệ số chuyển đổi của protein.
Hàm lượng protein = %N x 6,25
3.5.3.4 Xác định hàm lượng tro toàn phần, đường tổng số, hàm lượng lipid tổng, hàm lượng vitamin C
Làm tương tự phần đánh giá nguyên liệu lêkima tươi mục 3.5.1
3.5.3.5 Xác định hàm lượng các vitamin thiamin, riboflavin và nicotinamid bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Cân chính xác khoảng 50 mg thiamine, 10 mg riboflavine, 200 mg
dung dịch acid acetic 1%, đun cách thủy và siêu âm cho đến khi tan hoàn toàn.
Để nguội, thêm dung dịch acid acetic 1% đến vạch, lắc đều.
Hút chính xác 5 mL dung dịch trên vào bình định mức 50 mL, thêm dung dịch acid acetic 1% đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 àm.
Chuẩn bị dung dịch thử: cân chính xác khoảng 5 g bột lêkima vào bình nón 250 mL, thêm chính xác 100 mL dung dịch acid acetic 1%, siêu âm nước ấm khoảng 30 phút, lắc thường xuyên. Để nguội, ly tâm hoặc lọc lấy phần dịch trong, lọc qua màng lọc 0,45 àm.
3.5.3.6 Xác định hàm lượng các khoáng chất bằng phương pháp quang phổ
Xác định hàm lượng calci, sắt
Cách tiến hành
Cân 5 g bột lêkima vào cốc sứ, làm ẩm, than hóa trên bếp điện rồi nung 550°C trong 2 giờ.
Sau đó để nguội, thêm 20 mL HCl 6 M, đun cách thủy 45 phút, rồi chuyển vào bình định mức 25 mL, tráng cốc nhiều lần bằng HCl 6 M, thêm vừa đủ đến vạch bằng HCl 0,125 N. Lọc lấy dịch lọc (dung dịch A), đem dung dịch A đo sắt với dóy chuẩn 1-2-3-4 àg/mL.
Dung dịch L: 26,7 g LaCl3 cho vào bình định mức 100 mL, thêm vừa đủ bằng HCl 0,125 N.
Hút 1 mL dung dịch A cho vào bình định mức 50 mL, thêm 0,5 mL dung dịch L, thờm vừa đủ bằng HCl 0,125 N, đem so với dóy chuẩn 1-3-5 àg/mL.
Xác định hàm lượng phospho
Cách tiến hành
Chuẩn bị dung dịch thử: cân khoảng 6 g bột lêkima cho vào cốc sứ. Trộn đều mẫu với 1 g calci carbonate. Than hóa trên bếp điện rồi nung 550ºC trong 2 giờ, đến khi thu được tro có màu trắng hoặc xám.
Chuyển toàn bộ tro vào becher 250 mL cùng 50 mL nước cất. Thêm HCl 6 M đến khi thấy hết sủi bọt. Sau đó thêm khoảng 10 mL HCl 6 M rồi đun trên bếp điện cho bay hơi để tạo một lớp oxide silic không hòa tan. Để nguội.
Thêm 10 mL acid nitric 1 M, đun trên bếp điện 5 phút, không làm bay hơi đến khô. Để lắng và gạn phần chất lỏng vào bình định mức 100 mL, tráng rửa cốc vài lần bằng nước nóng. Để nguội, thêm nước cất đến vạch, lắc đều và lọc.
Hút chính xác 10 mL dung dịch thử cùng với thêm 10 mL dung dịch thuốc thử molidovanadat vào ống nghiệm. Lắc đều, để yên 10 phút. Tiến hành đo độ hấp thụ trong quang phổ ở bước sóng 430 nm.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Cân khoảng 0,16 g phospho chuẩn cho vào cốc sứ rồi tiến hành tương tự như chuẩn bị dung dịch thử.
3.5.3.7 Xác định hàm lượng kim loại nặng bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử
Nguyên tắc chung
Khi nguyên tử tồn tại tự do ở thể khí và ở trạng thái năng lượng cơ bản, thì nguyên tử không thu hay không phát ra năng lượng. Song, nếu chiếu vào đám hơi nguyên tử tự do một chùm tia sáng đơn sắc có bước sóng phù hợp, trùng với bước sóng vạch phổ phát xạ đặc trưng của nguyên tố phân tích, chúng sẽ hấp thụ tia sáng đó sinh ra một loại phổ của nguyên tử. Phổ này được gọi là phổ hấp thụ của nguyên tử. Với hai kỹ thuật nguyên tử hóa, nên chúng ta cũng có hai phép đo tương ứng. Đó là phép đo phổ hấp thụ nguyên tử trong ngọn lửa (F-AAS có độ nhạy cỡ 0,1 ppm) và phép đo phổ hấp thụ nguyên tử không ngọn lửa (GF-AAS có độ nhạy cao hơn kỹ thuật ngọn lửa 50-1000 lần, cỡ 0,1-1 ppb).
Xác định hàm lượng chì, cadimi bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa F-AAS
Quy trình chuẩn bị mẫu phân tích
Cho vào 2 cốc sứ mỗi chén khoảng 18,6 g bột lêkima, thêm 0,25 g Mg(NO3)2 và 1 mL HNO3 35% vào mỗi chén, trộn đều, đem nung 3 giờ ở 450ºC, sau đó nung 2 giờ ở 550°C.
Hòa tan tro thu được trong bình Kjeldahl bằng dung dịch HNO3:HClO4
theo tỷ lệ 4:1, đun sôi nhẹ để tan hết cặn.
Định mức các dung dịch thu được bằng nước cất hai lần đến 50 mL rồi đem xác định hàm lượng các kim loại bằng phép đo F-AAS.
Xác định hàm lượng thủy ngân bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử không ngọn lửa GF-AAS
Quy trình chuẩn bị mẫu Vô cơ hóa mẫu
Cân khoảng 18 g mẫu bột lêkima cho vào bình phá mẫu. Thêm 5 mL acid nitric đậm đặc rồi vặn chặt nắp, đậy kín bình lại.
Cho dung dịch vào tủ sấy ở nhiệt độ 150ºC trong vòng 30-60 phút hoặc cho đến khi dung dịch trở nên trong.
Lấy bình ra khỏi tủ sấy, để nguội đến nhiệt độ phòng rồi mở nắp và chuyển dung dịch mẫu vào bình định mức 250 mL. Tráng rửa bình phá mẫu bằng 100 mL hỗn hợp acid sulfuric và acid nitric tỷ lệ 1:1, sau đó định mức đến vạch bằng nước cất rồi lắc đều.
Chuẩn bị mẫu trắng
Mẫu trắng được chuẩn bị bằng cách thay 18 g mẫu bằng 18 mL nước cất rồi tiến hành theo các bước như quá trình vô cơ hóa mẫu.
3.5.3.8 Phương pháp phân tích chỉ tiêu vi sinh
Vì thời gian thực hiện đề tài còn hạn chế nên chỉ tiêu vi sinh chỉ được kiểm tra định kỳ 2 lần, cách nhau khoảng 30 ngày. Mẫu được gửi kiểm tại phòng Kiểm nghiệm Công ty Cổ phần Dược Hậu Giang với các chỉ tiêu sau:
+ Kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí (TSVSVHK) theo TCVN 4884:2005 + Kiểm tra vi khuẩn tổng số Coliform theo TCVN 4882:2007
+ Kiểm tra vi khuẩn tổng số Escherichia coli theo TCVN 7924-1:2008 + Xác định tổng số Staphylococcus aureus: theo TCVN 4830-1:2005 + Xác định Bacillus cereus theo TCVN 4992: 1989
+ Xác định Salmonella theo TCVN 6402:1998
+ Xác định Clostridium perfringens theo TCVN 4991:2005 3.5.3.9 Xác định hàm lượng β-carotene
Gửi mẫu đi phân tích tại Trung tâm dịch vụ Phân tích thí nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh – CASE (02 Nguyễn Văn Thủ, Phường Đakao, Quận 1, TP.HCM).
Phương pháp phân tích: sắc ký lỏng hiệu năng cao.
CHƯƠNG 4