trên phiến kắnh
3.4.3.1. Phương pháp xác ựịnh vi khuẩn Salmonella spp bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kắnh với kháng huyết thanh ựa giá (polyOH)
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kháng huyết thanh ựa gia PolyOH của Hãng SiFIN CHLB đức.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 43
Cách tiến hành phản ứng:
- Trên phiến kắnh sạch mỗi ựầu nhỏ 1 giọt nước sinh lý ựã hấp vô trùng, dùng que cấy vô trùng lấy 1/2 - 1/4 khuẩn lạc cần ựịnh typ từ thạch ựĩa nuôi cấy, trộn ựều khuẩn lạc và nước sinh lý ở mỗi ựầu phiến kắnh tạo thành huyễn dịch vô trùng.
- Dùng que cấy vô trùng khác lấy 1 vòng que cấy kháng huyết thanh ựa giá PolyOH hòa ựều vào huyễn dịch vô trùng ở một ựầu phiến kắnh, còn ựầu kia không cho kháng huyết thanh dùng làm ựối chứng, rồi quan sát bằng mắt thường hoặc kắnh lúp.
+ Phản ứng ngưng kết ựược coi là dương tắnh khi có sự hình thành các hạt ngưng kết nhỏ li ti phân bổ ựều sau 30 giây khi cho kháng huyết thanh.
+ Phản ứng âm tắnh: huyễn dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh không có hiện tượng ngưng kết huyễn dịch vẩn ựục ựều như bên ựối chứng.
+ Trong trường hợp nếu vi khuẩn có khả năng tự ngưng kết (tức là khi cho vi khuẩn hòa với nước muối sinh lý có hình thành ngưng kết nhiều hoặc ắt) thì chủng này ựược coi là tự ngưng kết và không thử nghiệm tiếp theo ựể phát hiện kháng nguyên nữạ
3.4.3.2. Xác ựịnh serotyp của vi khuẩn Salmonella bằng kháng huyết thanh ựơn giá (O5, O9) và xác ựịnh kháng nguyên lông ựể ựịnh danh vi khuẩn
Căn cứ vào kết quả xác ựịnh kháng nguyên ựa giá PolyOH, tiến hành xác ựịnh cấu trúc kháng nguyên O ựơn giá của từng chủng vi khuẩn Salmonella
thuộc nhóm có kết quả dương tắnh ở trên bằng kháng huyết thanh ựơn giá (O5, O9) của hãng SiFIN Cộng hòa Liên bang đức. Quy trình và cách ựánh giá tương tự như ở trên.
Căn cứ vào kết quả xác ựịnh cấu trúc kháng nguyên O rồi xác ựịnh kháng nguyên H ựể ựịnh danh vi khuẩn phân lập ựược theo bảng cấu trúc kháng nguyên của Kaufmann.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 44
3.4.3.3. Phương pháp xác ựịnh kháng nguyên H (theo phương pháp của GARD).
Kháng nguyên H có ý nghĩa rất quan trọng cho việc ựịnh danh chắnh xác serotyp Salmonella. Bởi vì nhiều serotyp Salmonella có cấu trúc kháng nguyên O trùng nhaụ Muốn xác ựịnh kháng nguyên H, trước hết ta cần phải nuôi cấy ựể thu hoạch ựược chúng. Hiện nay có 3 phương pháp nuôi cấy ựể thu ựược kháng nguyên H, ựó là:
- Phương pháp nuôi cấy trong ống hình chữ Ụ
- Phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch SIM có ống Craig.
- Phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch GARD (phương pháp GARD).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp GARD và ựược tiến hành như sau:
1. Chuẩn bị môi trường thạch GARD: ựây là môi trường bán cố thể, có bán sẵn trên thị trường; pha môi trường theo hướng dẫn của hãng sản xuất. đĩa ựể ựổ thạch GARD, dùng ựĩa có ựường kắnh phi 6.
2. Sau khi ựã có thạch GARD, chúng tôi dùng que cấy vô trùng lấy một ắt vi khuẩn ựã ựược xác ựịnh KN-O chấm nhẹ lên mặt thạch GARD (không ria cấy).
3. Nuôi ở 370C trong 24 giờ. Nếu có kháng nguyên lông H thì vi khuẩn sẽ mọc lan khắp bề mặt ựĩa thạch GARD.
4. Tiến hành làm ngưng kết nhanh trên phiến kắnh ựể xác ựịnh KN-H. Do KN-H hầu như không xuất hiện ựồng thời cả hai pha, nên sau khi xác ựịnh ựược một pha nào ựó ta tiến hành xác ựịnh pha khác.
Vắ dụ: Xác ựịnh KN-H của S.typhimurium: có 2 pha KN-H là Hi và H1,2. Sau khi tiến hành lần ựầu nuôi cấy trên thạch GARD ta tìm ựược Hi, tiếp theo tiến hành nuôi cấy xác ựịnh KN-H1,2, như sau:
1- Chuẩn bị thạch GARD.
2- Pha chế thạch như ựã mô tả ở trên, tuy nhiên trước khi ựổ thạch ra ựĩa nhỏ vào ựĩa một giọt kháng huyết thanh Hi Anti Gard serum với mục ựắch ức chế pha 1.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 45
Các bước 2, 3, 4 tiến hành tương tự như trên (bước 4 tiến hành ngưng kết với kháng huyết thanh H1,2).
Bảng 3.1. Bảng ựịnh typ huyết thanh học (serotyp) của vi khuẩn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Salmonella Ờ theo Kauffmann (1972)
Kháng nguyên H Nhóm Typ Kháng nguyên O Pha 1 Pha 2 A S.paratyphi A 1,2,12 a /1,5/ S.paratyphi B 1, 4,/5/,12 b 1,2 S.abortusovis 4,2 c 1,6 S.saintpaul 1, 4,5,12 e,h 1,2 S.agona 1, 4,12 f,g,s - S.typhimurium 1, 4,/5/,12 i 1,2 S.heidelberg 1, 4,/5/,12 r 1,2 B S.abortusequi 4,12 - e,n,x S.paratyphi C 6,7,/Vi/ c 1,5 S.choleraesuis 6,7 c 1,5 S.choleraesuis var Kunzendorf 6,7 - 1,5 S.typhisuis 6,7 c 1,5 S.montevideo 6,7,14 g,m,/p/,s /1,2,7/ S.thompon 6,7,14 k 1,5 S.virchow 6,7 r 1,2 C1 S.infantis 6,7,14 r 1,5 S.enteritidis 1,9,12 g,m,/p/ /1,7/ S.dublin 1,9,12 g,p - S.typhi 9,12,Vi d - S.gallinarum 1,9,121,123 - - S.pullorum 9,12 - - D1 S.panama 1,9,12 i,v 1,5
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 46