1993E có cải tiến vì lý do kỹ thuật hoặc thiếu môi trường
SƠ đỒ: CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH PHÂN LẬP
Vi khuẩn Salmonella cải tiến theo ISO 6579 : 1993 (E)
Lấy 25 gram mẫu thử
Môi trường không chọn lọc Buffered pepton water 225 ml nuôi cấy ở 370C, 16 - 20 giờ
10 ml môi trường tăng sinh chọn lọc Rappaport vasiliadis nuôi cấy ở 41,5 ổ 0,50C. Trong 24 Ờ 48 giờ
10 ml môi trường tăng sinh chọn lọc Rappaport vasiliadis nuôi cấy ở 41,5 ổ 0,50C. Trong 24 Ờ 48 giờ
Nuôi cấy trong môi trường thạch thường ở 370C trong 18 Ờ 24 giờ
Giám ựịnh sinh hóa học Giám ựịnh huyết thanh học
Ria cấy trên môi trường chọn lọc
Ria cấy trên môi trường chọn lọc thứ nhất MacConkeỵ
Nuôi cấy: 370C trong 18 Ờ 24 giờ
Ria cấy trên môi trường chọn lọc thứ 2 Xylose lysine desoxycholate agar (XLD). Nuôi cấy: 370C trong 18 Ờ 24 giờ
Chọn 5 khuẩn lạc ựặc trưng
đÁNH GIÁ KẾT QUẢ
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 41
* Tăng sinh không chọn lọc:
- Mẫu nghiên cứu là bệnh phẩm (gan, lách, manh tràng): ựược lấy ựảm bảo tránh tối ựa vi khuẩn tạp nhiễm bằng cách nhúng bệnh phẩm vào cồn sát trùng ựốt qua ựèn cồn phắa ngoàị Một phần bệnh phẩm cấy trực tiếp vào môi trường thạch MacConkey và XLD. Phần còn lại nghiền nhỏ và cho vào môi trường tăng sinh không chọn lọc (Buffered pepton water tỷ lệ 1:10), ựể tủ ấm 370C từ 16 Ờ 20 giờ.
- Mẫu nghiên cứu là trứng thương phẩm:
+ Lấy lòng ựỏ trứng cho vào bình tam giác vô trùng, cho 250ml môi trường tăng sinh không chọn lọc (Buffered pepton water) (tương ựương tỷ lệ 1g lòng ựỏ : 9ml môi trường), lắc ựều, ựể tủ ấm 370C trong 16 Ờ 20 giờ.
+ Vỏ trứng cắt nhỏ cho vào bình tam giác vô trùng, cho môi trường tăng sinh không chọn lọc (Buffered pepton water) (tương ựương tỷ lệ 1g vỏ trứng : 9ml môi trường), ựể tủ ấm 370C trong 16 Ờ 20 giờ.
- Mẫu nghiên cứu là trứng tắc: lấy toàn bộ nội tạng của quả trứng tắc cho vào môi trường tăng sinh không chọn lọc (Buffered pepton water) theo tỷ lệ 25g mẫu với 225ml môi trường (1:10). để tủ ấm 370C trong 16 Ờ 20 giờ.
- Mẫu nghiên cứu là phân: phân lấy ngẫu nhiên trên nền chuồng, cho vào môi trường tăng sinh không chọn lọc (Buffered pepton water) theo tỷ lệ 1:10 (trường hợp lấy phân bằng tăm bông ngoáy sâu trong trực tràng thì cho cả tăm bông vào môi trường tăng sinh không chọn lọc (Buffered pepton water). để tủ ấm 370C trong 16 Ờ 20 giờ.
* Tăng sinh chọn lọc: Lấy 1 ml và 0,1ml dung dịch tăng sinh không chọn
lọc cho vào môi trường tăng sinh chọn lọc (RV) nuôi cấy ở 420C trong 24 giờ. Các bước tiếp theo tiến hành như sơ ựồ ISO 6579 Ờ 1993Ẹ
Trên môi trường XLD sau 24 giờ ựể tủ ấm 370C khuẩn lạc có màu ựen, tròn, bóng, lồi lên trên mặt thạch.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 42
Trên môi trường MacConkey sau 24 giờ ựể tủ ấm 370C khuẩn lạc không màu, tròn, trong, nhẵn bóng.
Chọn những khuẩn lạc ựiển hình trên 2 môi trường XLD và MacConkey ria cấy trên môi trường thạch thường ựã làm khô lớp mặt sao cho chúng phát triển thành những khuẩn lạc riêng biệt ựể rễ chọn lọc.
Kiểm tra ựặc tắnh sinh hóa của vi khuẩn Salmonella trên môi trường Kligler (đức) bằng cách ria cấy trên bề mặt thạch nghiêng và cấy trắch sâu một ựường xuống gần ựáy ống nghiệm, ựể tủ ấm 370C trong vòng 24 giờ sau ựó ựọc kết quả:
+ Nếu phần thạch ở ựáy ống nghiệm có màu vàng: Glucose dương tắnh. + Nếu có bọt khắ: sinh hơi dương tắnh.
+ Nếu dọc ựường trắch sâu có màu ựen: H2S dương tắnh. + Nếu trên mặt thạch nghiêng có màu hồng: Lactose âm tắnh.
Kiểm tra di ựộng bằng cách: Bẻ que cấy một góc 15 ựộ, chấm nhẹ lên khuẩn lạc nghi Salmonella rồi chấm nhẹ lên ựiểm giữa của bề mặt thạch ựĩa GARD; ựể tủ ấm 370C trong 24 giờ rồi ựọc kết quả, vi khuẩn di ựộng sẽ mọc lan tỏa từ ựường cấy ra xung quanh.
Phản ứng sinh Indol: sau khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường có Trytophan ở tủ ấm 370C trong 24 giờ, nhỏ vào mỗi ống 1 Ờ 2 giọt dung dịch Kovacs, nếu không tạo thành vòng tròn màu ựỏ ở trên bề mặt ống nghiệm thì phản ứng sinh Indol âm tắnh.