PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIÊN CỨU
3. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1. Quy trình phân lập vi khuẩn L.sporogenes
3.1.1. Nguyên liệu phân lập.
Dùng chế phẩm Biobaby.
3.1.2. Các bước phân lập
Sơ đồ 2. 2: Các bước phân lập vi khuẩn L.sporogenes.
❖ Giải thích sơ đồ nghiên cứu:
Bước 1. Lấy mẫu: mẫu chuẩn bị là chế phẩm đã được tăng sinh trong môi
trường MRS canh ủ ở 370C/48 giờ sau đó pha loãng với nước cất vô trùng 9‰ tới nồng độ 10-5 trước khi tiến hành phân lập.
Đặc điểm sinh hóa Đặc điểm hình thái tế bào
vi khuẩn
Định danh vi khuẩn phân lập được
Khảo sát hình thái khuẩn lạc Lấy mẫu
Phân lập
Khảo sát
Giữ giống thuần vi khuẩn
L.sporogenes phân lập được
Bước 2. Phân lập: từ mẫu đã được pha loãng hút 0.1 mL (mẫu ở nồng độ
10-4 và 10 -5) cấy trang trên đĩa thạch MRS trong điều kiện vô trùng ủ ở 370C/48 giờ.
Bước 3. Khảo sát:
- Khảo sát hình thái khuẩn lạc: bằng mắt thường quan sát các đặc điểm đặc trưng của khuẩn lạc trên đĩa phân lập.
- Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn: bằng phương pháp nhuộm gram quan sát hình dạng tế bào của vi khuẩn L.sporogenes dưới kính hiển vi vật kính X100.
- Đặc điểm sinh hóa: bằng các thử nghiệm lên men và thử nghiệm sinh hóa đặc trưng của vi khuẩn để định danh vi khuẩn phân lập được.
Bước 4. Định danh vi khuẩn phân lập được: thông qua các nghiên cứu
trên cùng với nguồn tài liệu tham khảo về vi khuẩn L.sporogenes, ta khẳng định lại vi khuẩn phân lập được đã được định danh.
Bước 5. Giữ giống: sau khi đã phân lập được vi khuẩn L.sporogenes ta tiến
hành giữ giống vi khuẩn trong điều kiện bảo quản nhiệt độ lạnh 8-90C trong tủ lạnh.
3.1.3. Sơ đồ quy trình phân lập [4].
Test sinh hóa
Tăng sinh Biobaby
MRS
Giữ giống Test sinh hóa
Dịch mẫu 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
Chọn khuẩn lạc nghi
ngờ
Nhuộm gram và làm thuần giống bằng cách cấy chuyền nhiều lần
Sơ đồ 2. 3: Quy trình phân lập L.sporogenes.
❖ Cách tiến hành.
Chế phẩm ở dạng bột, cân khoảng 1 gam chế phẩm tăng sinh trong ống nghiệm chứa sẵn 9 mL môi trường tăng sinh chọn lọc MRS canh đem ủ ở 370C/48 giờ trong điều kiện yếm khí. Hút 10 mL mẫu chế phẩm Biobaby pha loãng với 90 mL
nước muối sinh lý 9‰ chứa trong erlen sẽ tạo thành dịch mẫu 10-1. Sau đó hút
1 mL dịch mẫu cho vào 9 mL nước muối sinh lý 9‰ trong ống nghiệm tạo thành
dịch mẫu 10-2
. Cứ thế tiếp tục pha loãng đến nồng độ 10-5
. Bằng thao tác vô trùng hút 0,1 mL dịch mẫu 10-4 và 10-5 lần lượt cấy vào môi trường MRS trong
MRSA
đĩa petri bằng que cấy trang rồi đem nuôi ở 370C/48 giờ trong điều kiện yếm khí. Chọn lấy khuẩn lạc đặc trưng, nghi ngờ của L.sporogenes: Tròn, trơn, lấp
lánh,...đem pha loãng và cấy phân lập trong môi trường MRS ủ trong điều kiện yếm khí ở nhiệt độ 370C/48 giờ. Cứ tiếp tục như thế cho đến khi khuẩn lạc mọc thuần nhất trên môi trường, kiểm tra sơ bộ sự thuần nhất của giống phân lập được bằng cách nhuộm gram, quan sát hình dạng, cách sắp xếp và kích thước…
Sau khi có được giống thuần cấy tiếp vào môi trường tăng sinh MRS.
Từ MRS tăng sinh tiến hành phân lập lại để có nhiều khuẩn lạc thuần, bắt khuẩn lạc tiến hành giữ giống trong môi trường MRS thạch nghiêng.
3.1.4. Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn [4].
Phương pháp thực hiện:
Phương pháp nhuộm gram.
Thao tác nhuộm gram : 3.1.4.1. Làm vết bôi.
Làm sạch lame kính, đánh dấu vị trí vết bôi và ghi ký hiệu cho tiêu bản.
Dùng que cấy vô trùng, bằng thao tác vô trùng, lấy một vòng canh khuẩn cho lên lame kính. Dàn đều giọt canh khuẩn, hơ nhẹ 3 – 4 lần trên đèn cồn cho khô.
3.1.4.2. Thuốc nhuộm và hóa chất.
• Thuốc nhuộm – Crystal violet – Fuchsin kiềm loãng
• Hóa chất – Dung dịch lugol – Cồn 960
3.1.4.3. Thao tác nhuộm.
Đặt mảnh giấy lọc lên vết bôi. Nhỏ thuốc nhuộm Crystal violet lên giấy lọc sao cho đủ thấm xuống vết bôi, để 2 phút. Rửa nước. Nhỏ dung dịch Lugol lên vết bôi vừa được nhuộm, để khoảng 1 phút. Rửa nước. Tẩy màu nhanh bằng cồn 960 trong 15-30 giây. Rửa nước. Đặt một mảnh giấy lọc lên vết bôi. Nhỏ
thuốc nhuộm Fuchsin kiềm loãng lên miếng giấy lọc sao cho đủ thấm xuống vết bôi, để khoảng 1 phút. Rửa nước. Thấm khô tiêu bản để xem dưới kính hiển vi.
3.1.4.4. Kết quả quan sát.
Tế bào được quan sát ở vật kính X100 có giọt dầu soi sau khi đã tiến hành nhuộm Gram.
• Vi khuẩm Gram dương bắt màu tím.
• Vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng.
Chú ý: vi khuẩn lên men lactic là vi khuẩn gram dương bắt màu tím. Nên
nhuộm vi khuẩn sau 24-48 giờ nuôi cấy. Vi khuẩn càng để lâu có thể bắt màu hồng.
Quan sát hình dạng, cách sắp xếp tế bào và kích thước tế bào vi khuẩn
L.sporogenes.
3.1.5. Khảo sát các phản ứng sinh hóa [2] [4] [15].
Để định danh L.sporogenes, ngoài hình thái khuẩn lạc và tế bào, còn cần đến những phản ứng sinh hóa đặc trưng.
Theo nguồn tài liệu tham khảo [15] ta có bảng liệt kê những đặc điểm chính của L.sporogenes.
Bảng 2. 1: Những đặc điểm sinh hóa chính của vi khuẩn L.sporogenes.
Đặc điểm L.sporogenes
Catalase +
Benzidine d
Nitrat d
Gram(+) +
Sinh bào tử +
Di động +
Sinh acid lactic +
Inulin -
Maltose +
Mannitol +
Raffinose +
Sorbitol -
Sucrose +
Trehalose +
Lactose +
Sinh hơi -
Ghi chú:
d: kết quả không đồng đều.
Sơ đồ 2. 4: Quy trình tiến hành thử nghiệm sinh hóa.
Giống thuần
Cấy sang các môi trường thử
sinh hóa
Phản ứng lên men đường
và sinh hơi
Catalase Nitrate Endospores Di động Sinh
acid lactic
3.1.5.1. Thử nghiệm lên men đường và sinh hơi [2] [15].
Thí nghiệm nhằm mục đích khảo sát khả năng sử dụng các chất hydratcarbon của L.sporogenes. Các vi sinh vật được đặc trưng bởi khả năng sử dụng không giống nhau các loại hydratcarbon để làm nguồn thức ăn carbon và năng lượng.
Thí nghiệm được thực hiện với các loại đường sau: mannitol, raffinose, sorbitol, sucrose, lactose.
a. Nguyên tắc.
Vi sinh vật có các enzym phân giải được các loại đường trên tạo thành các acid hữu cơ làm giảm độ pH của môi trường. Ngoài ra quá trình phân giải đường còn có thể tạo ra các chất khí như: CO2, H2..Để phát hiện sự giảm pH của môi trường do sự tạo thành các acid hữu cơ, tức là có sự phân giải đường, người ta sử dụng các chất chỉ thị màu mà màu sắc của chúng sẽ thay đổi tùy theo độ pH của môi trường. Và để phát hiện sự hình thành các chất khí, người ta cho vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật một ống phao úp ngược (còn gọi là ống durham).
Trong trường hợp vi sinh vật sử dụng được loại đường có trong môi trường và có tạo khí thì chất khí này sẽ tích tụ trong ống phao, đẩy môi trường bên trong ống phao ra ngoài, chiếm chỗ tạo thành khoảng trống ở trong phao và màu sắc của chỉ thị màu môi trường sẽ thay đổi.
b. Môi trường và chất chỉ thị màu.
⮚ Môi trường nuôi cấy: là môi trường canh dinh dưỡng có pH khoảng 6,9 – 7,2 có chứa khoảng 1% đường cần khảo sát.
⮚ Chỉ thị màu: dùng chất chỉ thị màu phenol red để thể hiện sự thay đổi
độ pH của môi trường.
Khoảng đổi màu của chỉ thị màu phenol red: pH = 6,9-8,4: màu đỏ và chuyển sang màu vàng khi pH<6,9 [11]
c. Tiến hành.
Dùng que cấy vòng, bằng thao tác vô trùng lấy vi sinh vật từ ống giống vi sinh vật cần nghiên cứu cấy sang môi lên men đường. Sau đó đặt ống môi trường
đã cấy vi sinh vật vào tủ ấm ở nhiệt độ 370C. Đọc kết quả sau 24 giờ nuôi cấy.
d. Kết quả quan sát.
Bảng 2. 2: Đọc kết quả của chỉ thị màu phenol red.
Chất chỉ thị màu
Màu của môi trường trước khi cấy vi sinh vật
Màu của môi trường sau khi nuôi cấy vi sinh vật ở 370C/24
giờ
Bọt khí trong ống durham
Kết quả Ghi
kết quả
Phenol red
Đỏ
Đỏ
Đỏ
Đỏ
Vàng
Vàng
Không có Không có
Có
Âm tính
Dương tính
Dương tính, sinh hơi
( - ) ( + )
( +h )
3.1.5.2. Thử nghiệm hoạt tính catalase [2].
a. Nguyên tắc.
Các vi sinh vật hiếu khí bắt buộc hay hiếu khí tùy nghi nhờ có enzyme catalase nên thường có khả năng phân giải H2O2 tạo thành nước và oxy. Trong phản ứng catalase dương tính, oxy sinh ra sẽ tạo thành bọt khí.
catalase
2H2O2 2H2O + O2
b. Thuốc thử
Nước oxy già H2O2
c. Thực hiện.
Dùng que cấy vòng, bằng thao tác vô trùng, lấy và trãi vi sinh vật kiểm định lên một miếng lame sạch. Sau đó nhỏ một giọt oxy già lên chỗ có vi sinh vật. Phản ứng sẽ xảy ra ngay lập tức.
d. Đánh giá kết quả.
Quan sát sự xuất hiện bọt khí:
• Có xuất hiện bọt khí: oxy được sinh ra bay lên. Phản ứng catalase dương tính.
• Không có xuất hiện bọt khí: không có oxy được sinh ra. Phản ứng catalase âm tính.
3.1.5.3. Khả năng sử dụng Nitrat [2].
a. Nguyên tắc.
Nitơ trong nitrat là dạng nitơ vô cơ. Một số vi khuẩn có khả năng sử dụng nitrat làm nguồn dinh dưỡng nitơ do chúng có enzyme Nitratreductase.
Nitrat có thể sẽ bị khử thành nitrit hoặc tiếp tục bị khử thành NH3 hay N2.
Trong trường hợp nitrat bị khử thành nitrit, khi có sự hiện diện của thuốc thử Griess bao gồm 2 loại: acid sulfanilic và α- naphthylamine, sẽ tạo thành hợp
chất có màu đỏ.
b. Môi trường và thuốc thử.
⮚ Môi trường: canh dinh dưỡng có chứa gốc NO3- (NB+0,2% KNO3).
⮚ Thuốc thử:
- Acid sulfanilic (Griess A)
- α- naphthylamine (Griess B)
c. Thực hiện.
Dùng que cấy vòng, bằng thao tác vô trùng, lấy và cấy vi khuẩn kiểm định vào trong môi trường. Nuôi cấy ở nhiệt độ 370C. Sau 24 giờ lấy ra đọc kết quả.
d. Đánh giá kết quả.
Nhỏ vài giọt thuốc thử acid sulfanilic và α- naphthylamine vào ống nghiệm đã được nuôi cấy vi khuẩn. Quan sát sự xuất hiện màu trong ống môi trường:
▪ Có sự xuất hiện màu đỏ da cam: nitrit đã được tạo thành. Phản ứng khử nitrat thành nitrit dương tính.
▪ Không thấy xuất hiện màu đỏ cam: không có nitrit trong môi trường.
Phản ứng khử nitrat thành nitrit âm tính.
Chú ý: màu đỏ chỉ tồn tại trong thời gian ngắn, do vậy kết quả phản ứng
phải được đọc ngay sau khi nhỏ thuốc thử.
3.1.5.4. Khảo sát khả năng hình thành bào tử (endospores) [2] [4].
3.1.5.4.1. Nguyên tắc hình thành bào tử.
Sự hình thành và hồi sinh của bào tử L.sporogenes chịu ảnh hưởng lớn bởi những điều kiện môi trường. Thí nghiệm sau đây được thực hiện nhằm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và môi trường nghèo dinh dưỡng theo thời gian là điều kiện tạo bào tử của vi khuẩn L.sporogenes.
3.1.5.4.2. Quy trình khảo sát.
ủ trong điều kiện yếm khí, 37oC/48 giờ
Sơ đồ 2. 5: Quy trình khảo sát sự hình thành bào tử L.sporogenes.
So sánh số lượng bào tử và đánh giá khả năng tạo thành bào tử.
Tăng sinh trong môi trường
MRS canh
Khảo sát khả năng tạo bào tử
Giống thuần
Tiếp tục nuôi, ủ 37oC/7 ngày Tiếp tục nuôi ủ 37oC/14 ngày
Ủ 70oC/4 giờ
Kiểm tra
số lượng bào tử tạo thành Nhuộm
bào tử Khảo sát bào tử Khảo sát bào tử
Kiểm tra
số lượng bào tử tạo thành Nhuộm
bào tử
Ủ 70oC/4 giờ
Kiểm tra
số lượng bào tử tạo thành Nhuộm
bào tử Khảo sát bào tử Khảo sát bào tử
Kiểm tra
số lượng bào tử tạo thành Nhuộm
bào tử
❖ Giải thích sơ đồ nghiên cứu:
٭ Giống thuần từ môi trường giữ giống ống thạch nghiêng ta cấy tăng sinh sang môi trường MRS canh nuôi trong điều kiện yếm khí ủ 370C/48 giờ.
٭ Khảo sát khả năng tạo thành bào tử: chia làm 2 mẫu.
- Mẫu 1 tiếp tục ủ 370C/7 ngày rồi tiến hành như sau:
• Đem khảo sát bào tử bằng cách nhuộm gram và sử dụng phương pháp kiểm tra số lượng bào tử tạo thành.
• Nâng nhiệt độ mẫu 1 lên 700C/4 giờ rồi cũng khảo sát bào tử như trên.
- Mẫu 2 tiếp tục ủ 370C/14 ngày rồi tiến hành như ở mẫu 1.
3.1.5.4.3. Phương pháp thực hiện.
A. Phương pháp nhuộm bào tử
Thao tác nhuộm bào tử:
a. Làm vết bôi.
Làm sạch lame kính, đánh dấu vị trí vết bôi và ghi ký hiệu cho tiêu bản.
Dùng que cấy vô trùng, bằng thao tác vô trùng, lấy một vòng canh khuẩn cho lên lame kính. Dàn đều giọt canh khuẩn và để khô tự nhiên.
b. Thuốc nhuộm và hóa chất.
- Thuốc nhuộm
• Fuchsin kiềm đặc.
• Xanh methylen.
- Hóa chất
• Dung dịch HCl 1%
• Cồn 960
c. Thao tác nhuộm.
- Nhỏ dung dịch HCl 1% lên vết bôi, để yên 1-2 phút.
- Rửa nước.
- Đặt mẫu giấy lọc lên vết bôi, nhỏ dung dịch fuchsin đậm đặc lên trên mẫu giấy lọc cho ngập mẫu giấy lọc, hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn trong khoảng
thời gian từ 2-4 phút.
- Bỏ giấy lọc, rửa nước.
- Nhúng tiêu bản vào cồn 960 (hoặc nhỏ cồn lên tiêu bản) để tẩy màu cho đến khi màu hồng của tiêu bản không còn phai nửa.
- Rửa nước.
- Nhỏ dung dịch xanh methylen lên vết bôi, để yên 1-2 phút.
- Rửa nước.
- Chậm khô, soi kính.
d. Kết quả quan sát.
Tế bào được quan sát ở vật kính X100 có giọt dầu soi sau khi đã tiến hành nhuộm bào tử.
❖ Tế bào vi khuẩn bắt màu xanh.
❖ Bào tử bắt màu hồng.
B. Phương pháp kiểm tra số lượng bào tử tạo thành.
a. Nguyên tắc.
Số lượng bào tử L.sporogenes tạo thành chỉ có thể đếm được sau khi đã pha loãng nhiều lần và cấy trang trên đĩa. Ngoài ra, để đánh giá chính xác số lượng bào tử trước khi cấy trang, tiến hành gia nhiệt những ống pha loãng ở nhiệt độ và thời gian thích hợp (1000C/10-30 phút) để tiêu diệt toàn bộ tế bào sinh dưỡng. Trong điều kiện này bào tử còn sống sau quá trình gia nhiệt sẽ hồi sinh trở lại khi cấy trang. Vì vậy, số khuẩn lạc đặc trưng thu nhận được cũng tương ứng với số bào tử trong dịch pha loãng.
b. Tiến hành.
Mẫu chuẩn bị là từ vi khuẩn giống được cấy tăng sinh trong môi trường MRS canh và đã qua các điều kiện tạo bào tử, tiến hành hút 1 mL và đồng nhất trong 9 mL NaCl 9‰ để có nồng pha loãng 10-1. Tiếp tục như thế cho đến nồng
độ pha loãng 10-6. Giữ 2 ống 10 -5 , 10-6 đem đặt vào tủ sấy và nâng nhiệt độ
1000C/10 phút. Hút 0,1 ml dịch khuẩn ở 2 nồng độ trên và trang trên môi trường thạch đĩa MRS, nuôi trong tủ ấm trong điều kiện yếm khí ở nhiệt độ 370C/48 giờ.
Đếm số khuẩn lạc trong mỗi đĩa và tính số bào tử có trong mẫu ban đầu.
c. Tính kết quả theo TCVN. [10]
Số vi khuẩn L.sporogenes có trong 1 g hay 1 mL dịch mẫu được tính theo công thức sau:
Công thức:
∑C V.(n1+0,1xn2).d Trong đó:
⮚ N: số vi khuẩn L.sporogenes có trong 1 ml dịch mẫu (CFU/mL).
⮚ ∑C: số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa đã chọn.
⮚ V: thể tích cấy trên mỗi đĩa (mL).
⮚ n1: số đĩa của độ pha loãng thứ nhất được giữa lại (10-5)
⮚ n2: số đĩa của độ pha loãng thứ hai được giữa lại (10-6)
⮚ d : hệ số pha loãng của độ pha loãng thứ nhất (10-5)
Số khuẩn lạc trung bình trong 1 g hay 1 mL mẫu sau 3 lần lập lại thí nghiệm
ở mỗi nghiệm thức.
Công thức:
Y N1 N 2 N3
3
Trong đó:
⮚ Y: số khuẩn lạc trung bình trong 1 mL mẫu sau 3 lần lập lại thí nghiệm
ở mỗi nghiệm thức (CFU/ mL).
⮚ N1: số vi khuẩn L.sporogenes có trong 1 g hay 1 mL dịch mẫu khi thí
nghiệm được lập lại lần 1.
⮚ N2: số vi khuẩn L.sporogenes có trong 1 g hay 1 mL dịch mẫu khi thí
nghiệm được lập lại lần 2.
⮚ N3: số vi khuẩn L.sporogenes có trong 1 g hay 1 mL dịch mẫu khi thí
nghiệm được lập lại lần 3.
N(CFU/ml)
3.1.5.5. Khả năng di động [2].
a. Nguyên tắc.
Một số vi sinh vật có tiêm mao giúp chúng có thể di động được. Khi cấy những vi sinh vật này vào trong môi trường bán lỏng, chúng sẽ di chuyển và mọc khắp nơi ngoài vết cấy ban đầu.
b. Môi trường.
Môi trường bán lỏng
c. Thực hiện.
Dùng que cấy thẳng, bằng thao tác vô trùng lấy và cấy vi sinh vật kiểm định theo phương pháp cấy chọc sâu vào những ống môi trường. Vết cấy có độ sâu khoảng 1/3 chiều cao của môi trường. Đánh dấu vị trí độ sâu của vết cấy.
Nuôi cấy ở 370C/24 giờ.
d. Đánh giá kết quả.
Quan sát sự mọc của vi sinh vật kiểm định so với vết cấy ban đầu:
• Vi sinh vật mọc lan ra khỏi phạm vi của vết cấy ban đầu, khắp môi trường: vi sinh vật di động. Phản ứng di động dương tính.
• Vi sinh vật mọc theo vết cấy ban đầu: vi sinh vật không di động. Phản ứng di động âm tính.
3.1.5.6. Khả năng sinh acid lactic [4].
Phương pháp thực hiện:
Định tính acid lactic
a. Nguyên tắc.
Acid lactic khi phản ứng với nhân phenol có trong thuốc thử uphenmen thì làm cho màu thuốc thử từ màu xanh tím chuyển sang vàng.
b. Thực hiện.
Nuôi cấy chủng vi sinh vật trong môi trường sữa đậu nành có bổ sung 0,2% glucose, nuôi trong điều kiện yếm khí ở 370C/48 giờ.
Hút 1 mL thuốc uphenmen cho vào ống nghiệm. Sau đó nhỏ bốn giọt dịch khuẩn nuôi cấy ở trên vào. Đọc kết quả.
c. Đánh giá kết quả.
Quan sát sự đổi màu của thuốc thử:
• Thuốc thử đổi từ xanh tím sang vàng: vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic. Phản ứng dương tính.
• Thuốc thử không đổi màu: không có acid lactic. Phản ứng âm tính.
Vi khuẩn lactic điển hình chủ yếu sản xuất acid lactic nên phản ứng dương tính.
3.1.6. Định danh vi khuẩn phân lập được và giữ giống.
Từ những kết quả nghiên cứu trên cùng với các tài liệu tham khảo về vi khuẩn ta khẳng định lại vi khuẩn mà ta đã phân lập được đã được định danh.
Sau khi đã phân lập được vi khuẩn L.sporogenes ta tiến hành giữ giống vi khuẩn thuần trong điều kiện bảo quản lạnh 8-90C trong tủ lạnh nhằm không làm thay đổi phẩm chất vi khuẩn trong suốt thời gian bảo quản. Giống được giữ trong ống thạch nghiêng MRS, thời gian bảo quản giống khoảng 1 tháng, ta tiến hành cấy chuyền nhiều lần để bảo quản giống được lâu hơn.