PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG THU SINH KHỐI
2.2. Nhân giống và khảo sát chọn môi trường sản xuất thích hợp
Số lượng tế bàoX1011
2.2.1. Nhân giống.
Hình 3. 12: Nhân giống vi khuẩn L.sporogenes trong môi trường NB.
Giống vi khuẩn L.sporogenes được tiếp tục nhân lên với số lượng lớn để đảm bảo về số lượng giống cần cho sản xuất. Trong quá trình nhân giống ta thường xuyên kiểm tra độ thuần của giống bằng phương pháp nhuộm gram cho kết quả như sau: hình dạng tế bào vi khuẩn L.sporogenes không bị biến dạng trong quá trình nhân giống và môi trường nhân giống không bị nhiễm khuẩn.
2.2.2. Khảo sát môi trường sản xuất.
Hình 3. 13: Vi khuẩn L.sporogenes lên men trong các môi trường sản xuất.
Trong các môi trường đậu nành và môi trường sữa giàu dinh dưỡng, vi khuẩn L.sporogenes lên men đường lactic cho sản phẩm có mùi đặc trưng và có khối đông tụ sữa. Trong quá trình lên men này, vi khuẩn L.sporogenes tạo một lượng sinh khối khác nhau trên các môi trường sản xuất khác nhau. Vì vậy, các
đánh giá chỉ tiêu sau giúp ta chọn được môi trường sản xuất nào là phù hợp nhất cho vi khuẩn L.sporogenes.
2.2.2.1. Khả năng làm đông tụ sữa.
Hình 3. 14: Vi khuẩn L.sporogenes lên men trong môi trường sản xuất sữa đặc
có đường.
Kết quả: sau 24 giờ và 48 giờ nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường sữa đặc
có đường ta thấy sữa không bị đông tụ, môi trường bị vón đục do có sự tạo thành dịch sinh khối. Phản ứng đông tụ sữa âm tính.
Hình 3. 15: Vi khuẩn L.sporogenes lên men trong môi trường sản xuất sữa bột.
Kết quả: sau 24 giờ và 48 giờ nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường sữa bột
ta thấy sữa bị đông dạng khối, có rất ít lớp nước trong (nhũ thanh lactoserum) được hình thành riêng biệt với khối sữa vón. Phản ứng đông tụ sữa dương tính.
Hình 3. 16: Vi khuẩn L.sporogenes lên men trong môi trường sản xuất đậu nành.
Kết quả: sau 24 giờ và 48 giờ nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường đậu nành
ta thấy có hiện tượng đông tụ dạng khối, có lớp nước trong (nhũ thanh lactoserum) được hình thành riêng biệt với khối đông tụ. Phản ứng đông tụ sữa dương tính.
So sánh 3 dạng đông tụ trên 3 loại môi trường sản xuất, ta nhận thấy ở môi trường sữa bột cho khối đông tụ nhiều và điển hình nhất có ý nghĩa rất quan trọng cho quá trình ly tâm thu sinh khối cho sản xuất.
2.2.2.2. Đo pH.
Bảng 3. 5: Kết quả đo pH trong các loại môi trường sản xuất sau khi nuôi vi
khuẩn L.sporogenes trong 370C/24 giờ và 370C/48 giờ.
Môi trường sản xuất pH
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Giá trị
trung bình
Môi trường sữa đặc có đường
Sau 24 giờ 6,3 6,01 6,43 6,25
Sau 48 giờ 5,5 4,52 4,97 5,0
Môi trường Sau 24 giờ 4,7 4,98 4,37 4,68
sữa bột Sau 48 giờ 4,2 4,42 4,19 4,27
Môi trường đậu nành
Sau 24 giờ 6,5 5,01 6,22 5,91
Sau 48 giờ 5,4 4,93 5,8 5,38
Biểu đồ 3. 3: So sánh pH trong các loại môi trường sản xuất sau khi nuôi vi
khuẩn L.sporogenes trong 370C/24 giờ và 370C/48 giờ.
6.25
4.68 5
4.27 5.91
5.38
0 1 2 3 4 5 6 7
Sữa đặc có đường Sữa bột
Môi trườngđậu nành
Kết quả đo pH trên cho thấy sinh vật phát triển trong các loại môi trường sản xuất có khả năng lên men đường lactose tạo ra acid lactic làm acid hóa môi trường. Độ pH đo được ở các môi trường sản xuất khác nhau theo thời gian nuôi cấy vi khuẩn. Môi trường sản xuất sữa bột có độ pH thấp nhất (4,68/24 giờ và 4,27/48 giờ) nghĩa là số lượng các ion hydro (H+) có nồng độ cao hơn và vi khuẩn L.sporogenes phát triển được trong môi trường này. Điều này rất có ý nghĩa trong khả năng lưu trú của vi khuẩn trên vật chủ.
2.2.2.3. Định lượng acid lactic (phương pháp đo độ chua Therner)
pH
370C/24 giờ 370C/48 giờ
Hình 3. 17: Chuẩn độ acid lactic bằng phương pháp đo độ chua Therner.
Với chỉ thị màu phenolphthalein ta chuẩn độ dung dịch cần đo đến pH>10 thì dung dịch đổi sang màu hồng phấn bền trong 5 phút thì dừng lại.
Bảng 3. 6: Giá trị độ Therner và lượng acid lactic do vi khuẩn L. sporogenes sản xuất sau khi nuôi vi khuẩn L.sporogenes được 370C/24 giờ và 370C/48 giờ
trong các loại môi trường sản xuất.
Môi trường sản xuất Độ Therner (0T) Số gam acid
lactic trong 100ml dịch lên men (g/100ml) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Giá trị
trung bình
Môi trường sữa đặc có đường
Sau 24 giờ 10,4 8,75 17,7 12,28 0,111
Sau 48 giờ 23,5 21,25 26,5 23,75 0,214
Môi trường sữa bột
Sau 24 giờ 35,2 54,25 31,75 40,4 0,364
Sau 48 giờ 50 69 58,25 59,08 0,532
Môi trường đậu nành
Sau 24 giờ 10,1 29,5 17,5 19,03 0,171
Sau 48 giờ 14 32,25 33,5 26,58 0,239
Biểu đồ 3. 4: So sánh lượng acid lactic do vi khuẩn L.sporogenes sản xuất sau khi nuôi vi khuẩn L.sporogenes được 370C/24 giờ và 370C/48 giờ trong các
loại môi trường sản xuất.
0.111
0.214 0.364
0.532
0.171
0.239
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
ữa đặc có đường Sữa bột
Môi trường đậu nành
Qua bảng trên, ta nhận thấy độ Therner biến động từ 12,28-59,08 tương ứng với lượng acid lactic do vi khuẩn L.sporogenes sinh ra là 0,111- 0,532 g/100ml và chúng tôi không tìm thấy một tài liệu nào ghi nhận rõ ràng về lượng acid lactic mà vi khuẩn L. sporogenes tạo ra.
Kết quả: trên môi trường sữa bột vi khuẩn L.sporogenes cho lượng acid lactic nhiều nhất là 0,532/48 giờ . Khả năng tạo acid lactic có ý nghĩa nhất định trong việc ứng dụng vi khuẩn L.sporogenes làm chế phẩm. Acid lactic giúp vi khuẩn L.sporogenes ức chế những vi khuẩn gây bệnh trong đường ruột vật chủ
và mang những lợi ích về mặt sinh lý cho vật chủ. Ngoài ra chúng tôi không tìm thấy một tài liệu nào ghi nhận rõ ràng về lượng acid lactic mà vi khuẩn L.
sporogenes tạo ra.
2.2.2.4. Nhuộm gram.
Kết quả: nhuộm gram và quan sát tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi ta
thấy hình dạng tế bào vi khuẩn L.sporogenes không bị biến dạng trong các môi trường sản xuất và môi trường sản xuất không bị nhiễm khuẩn.
2.2.2.5. Kiểm tra số lượng tế bào.
Số gam acid lactic/100 mL
370C/24 giờ 370C/48 giờ
Để kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn có trong các môi trường sản xuất, ta cấy phân lập vi khuẩn L.sporogenes trong các môi trường sản xuất này lên môi
trường thạch MRS.
Bảng 3. 7: Kết quả kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn L.sporogenes
trong các môi trường sản xuất.
Biểu đồ 3. 5: So sánh số lượng tế bào vi khuẩn L.sporogenes trong các
môi trường sản xuất.
Số lần lập lại
Môi trường sản xuất
N1 (CFU/mL)
N2 (CFU/mL)
N3 (CFU/mL)
Y (CFU/mL)
Môi trường sữa đặc có đường
Sau
24 giờ
7,76.1010 9,79.1010 1,02.1011 9,25.1010
Sau
48 giờ
1,5.1012 1,56.1012 1,53.1012 1,53.1012
Môi trường sữa bột
Sau
24 giờ
1,53.1011 1,49.1011 1,56.1011 1,53.1011
Sau
48 giờ
2,05.1012 2,13.1012 2,18.1012 2,12.1012
Môi trường đậu nành
Sau
24 giờ
8,94.1010 9,45.1010 9,0.1010 9,13.1010
Sau
48 giờ
9,3.1011 8,12.1011 1,04.1012 9,27.1011
0.925
15.3
1.53
21.2
0.913
9.27
0 5 10 15 20 25
Sữa đặc có đường Sữa bột
Môi trường đậu nành
Từ bảng biểu trên ta nhận thấy số lượng tế bào vi khuẩn L.sporogenes tăng lên theo thời gian nuôi cấy trong các loại môi trường sản xuất (số lượng tế bào vi khuẩn L.sporogenes nuôi trong 24 giờ ít hơn số lượng tế bào vi khuẩn L.sporogenes nuôi trong 48 giờ) và tỉ lệ gia tăng từ 10-20 CFU/mL. Như vậy, ta
chọn thời gian nuôi cấy vi khuẩn L.sporogenes trong các môi trường sản xuất là
48 giờ để có số lượng tế bào nhiều nhất. Ngoài ra, trong môi trường sữa bột sau khi nuôi vi khuẩn 370/48 giờ có số lượng tế bào vi khuẩn là nhiều nhất:
- Môi trường sữa đặc có đường: 1,53.1012 CFU/mL.
- Môi trường sữa bột: 2,12.1012 CFU/mL.
- Môi trường đậu nành: 9,27.1011 CFU/mL.
Kết luận chung: từ những kết quả chỉ tiêu đánh giá của quá trình khảo sát nêu trên ta chọn được môi trường sản xuất thích hợp nhất cho vi khuẩn
L.sporogenes là môi trường sữa bột. Trên môi trường sữa bột vi khuẩn
L.sporogenes phát triển tốt nhất so với các môi trường khác và cho lượng sinh khối lớn đáp ứng được yêu cầu ứng dụng trong sản xuất.