PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIÊN CỨU
3. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.2. Khảo sát quá trình nhân giống thu sinh khối L.sporogenes
3.2.1. Tăng sinh vi khuẩn L.sporogenes và chọn môi trường tăng sinh thích hợp.
Sơ đồ 2. 6: Quy trình tăng sinh vi khuẩn L.sporogenes 3.2.1.1. Tăng sinh giống.
- Pha môi trường tăng sinh NB và NB+1% glucose được chỉnh ở pH=5,6±0,2, đem hấp vô trùng trong nồi hấp ở nhiệt độ 1210C/15 phút.
Giống thuần L.sporogenes
Tăng sinh
Chọn môi trường tăng sinh thích hợp
• NB
• NB+1% glucose
Nhuộm gram Đếm số lượng tế bào
- Để nguội môi trường trên rồi cấy giống L.sporogenes thuần đã được phân lập và giữ giống.
- Ủ giống đã được cấy trong tủ ấm 370C/48 giờ ở điều kiện yếm khí.
3.2.1.2. Chọn môi trường tăng sinh thích hợp.
Giống L.sporogenes thuần sau khi được cấy tăng sinh trên hai môi trường
NB và NB+1% glucose với cùng một thể tích như nhau, ta tiến hành quan sát tế bào và kiểm tra độ nhiễm khuẩn trên kính hiển vi bằng phương pháp nhuộm gram và đếm số lượng tế bào trên môi trường thạch MRS để chọn ra môi trường tăng sinh phù hợp phục vụ cho quá trình sản xuất.
Môi trường tăng sinh phù hợp được chọn cho vi khuẩn L.sporogenes sử dụng là môi trường cho kết quả kiểm tra:
- Nhuộm gram: vi khuẩn L.sporogenes có đặc điểm hình dạng bình thường như giống vi khuẩn thuần và môi trường không bị nhiễm khuẩn.
- Kiểm tra đếm số lượng tế bào trên môi trường MRS có số lượng nhiều hơn.
3.2.2. Nhân giống và khảo sát môi trường sản xuất thích hợp
Sơ đồ 2. 7: Quy trình nhân giống và khảo sát môi trường sản xuất thích hợp cho
vi khuẩn L.sporogenes.
Nhân giống
Giống thuần L.sporogenes trên môi
trường tăng sinh đã được chọn
Kiểm tra độ thuần của giống (nhuộm gram)
Cấy giống lên men trong môi trường sản xuất
Chọn môi trường sản xuất thích hợp
Đếm số lượng tế bào
Đo pH Chuẩn độ acid Nhuộm gram
• Môi trường đậu nành
• Môi trường sữa
3.2.2.1. Nhân giống.
Môi trường được sử dụng để nhân giống vi khuẩn là môi trường tăng sinh thích hợp đã chọn. Giống thuần L.sporogenes sau khi cấy tăng sinh nhằm khôi phục lại những chức năng sinh lý của giống vi khuẩn sau thời gian bảo quản (vài tuần đến 1 tháng), ta tiến hành nhân giống nhằm để gia tăng số lượng giống chuẩn bị cho bước tiếp theo. Cấy dịch tăng sinh vào môi trường nhân giống với
tỷ lệ cấy giống 10%, được nuôi trong điều kiện yếm khí ở nhiệt độ 370C/48 giờ.
Trong quá trình nhân giống, ta thường xuyên tiến hành nhuộm gram để kiểm tra
độ thuần của giống.
3.2.2.2. Khảo sát môi trường sản xuất thích hợp cho vi khuẩn L.sporogenes.
3.2.2.2.1. Chuẩn bị môi trường sản xuất (trong 1 lít môi trường).
a. Môi trường đậu nành.
- Cân 100 g hạt đậu nành và ngâm trong nước ấm 4-8 giờ.
- Vớt hạt đậu nành ra để ráo nước.
- Sây nhuyễn hạt đậu nành với nước cất với một lượng vừa phải khoảng
400 ml.
- Sau đó dùng vải lọc thông thường để lọc bỏ bả.
- Ta thêm nước cất vào bả lọc cho đến khi thu được lượng dung dịch đậu nành là 1 lít thì dừng quá trình lọc.
- Bổ sung vào 1 lít dung dịch đậu nành thu được 20 g glucose rồi đem hấp vô trùng ở nhiệt độ 1100C/10 phút
b. Môi trường sữa.
- Cân 380 g sữa bột hay sữa đặc có đường đồng nhất trong 1 lít nước cất.
- Đem các loại môi trường sữa trên hấp vô trùng ở nhiệt độ 1100C /10 phút.
3.2.2.2.2. Cấy giống.
Giống chuẩn bị là giống thuần đã được nhân lên với số lượng lớn, ta tiến hành cấy giống vào môi trường sản xuất đã pha sẵn.
Giống được cấy với tỷ lệ cấy giống 10% vào các loại môi trường sản xuất
đã để nguội và đem nuôi trong điều kiện yếm khí ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ và
48 giờ.
3.2.2.2.3. Chọn môi trường sản xuất thích hợp cho vi khuẩn
L.sporogenes.
Ta tiến hành kiểm tra quá trình lên men của vi khuẩn L.sporogenes trong các loại môi trường sản xuất sau 24 giờ và 48 giờ nuôi cấy. Để chọn được môi trường sản xuất tốt nhất cho vi khuẩn L.sporogenes nhằm ứng dụng vào trong sản xuất thì phải dựa trên các chỉ tiêu đánh giá sau:
- Có sự tạo thành của khối đông tụ sữa, có lớp nước trong (nhũ thanh lactoserum) được hình thành riêng biệt với khối sữa vón.
- Đo độ pH xem khả năng chịu pH của vi khuẩn L.sporogenes.
- Chuẩn độ acid để biết được lượng acid lactic tạo thành trong quá trình lên men.
- Nhuộm gram xem hình dạng tế bào vi khuẩn không thay đổi và môi trường không bị nhiễm khuẩn.
- Kiểm tra số lượng tế bào trong môi trường sản xuất là lớn nhất.
Những chỉ tiêu trên được lập lại 3 lần ở hai mốc thời gian sau 24 giờ và
48 giờ nuôi vi khuẩn trong các loại môi trường sản xuất thử nghiệm.
A. Thử nghiệm khả năng làm đông tụ sữa.
Một số vi sinh vật phát triển trong sữa có khả năng lên men đường lactose tạo ra acid lactic làm acid hóa môi trường sữa, làm cho casein của sữa bị đông lại dạng khối.
a. Môi trường
Môi trường đậu nành và môi trường sữa
b. Thực hiện
Bằng thao tác vô trùng, cấy vi sinh vật kiểm định vào môi trường sữa và môi trường đậu nành. Sau đó, đặt môi trường đã cấy vi sinh vật vào tủ ấm trong điều kiện yếm khí ở 370C. Đọc kết quả sau 24 giờ và 48 giờ nuôi cấy.
c. Đánh giá kết quả
Quan sát trạng thái vật lý và màu của sữa:
• Sữa bị đông dạng khối, có lớp nước trong (nhũ thanh lactoserum) được hình thành riêng biệt với khối sữa vón. Phản ứng đông tụ sữa dương tính.
• Sữa không bị đông dạng khối, không có lớp nước trong (nhũ thanh lactoserum) được hình thành riêng biệt. Phản ứng đông tụ sữa âm tính.
Vi khuẩn lactic khả năng đông tụ sữa dương tính.
B. Phương pháp đo pH [18].
a. Nguyên tắc
Đo pH là phương pháp đo độ axit hoặc kiềm. Số lượng các ion hydro (H+) quyết định dung dịch có tính axit (nồng độ cao của các ion hydro) hay kiềm (thấp nồng độ ion hydro). Phạm vi pH được đo 0-14. Quy mô pH có nguồn gốc từ phân
ly nước liên tục trong phương trình sau đây:
H2O H+ + OH- Hằng số điện ly của nước (Kw) = 1,011 x 10−14 ở 250C
b. Thực hiện
Mẫu cần đo được pha loãng 10 lần trước khi đo. Nhúng đầu điện cực của máy đo pH vào dung dịch cần đo.
c. Kết quả
Ghi nhận kết quả giá trị pH được hiển thị trên thiết bị cho biết nồng độ H+
có trong dung dịch ở mỗi lần thí nghiệm.
Thí nghiệm lập lại 3 lần, lấy kết quả trung bình.
C. Định lượng acid lactic (Đo độ chua Therner) [19].
a. Nguyên tắc
Chuẩn độ dung dịch acid lactic bằng dung dịch chuẩn NaOH là phương pháp hóa học định lượng. Bản chất của sự chuẩn độ trung hoà (chuẩn độ acid- bazơ) là dùng dung dịch chuẩn là bazơ mạnh NaOH để chuẩn độ acid lactic, pH của dung dịch thu được thay đổi liên tục trong quá trình chuẩn độ. Để xác định điểm tương đương ta phải dùng chất chỉ thị. Cần phải chọn chất chỉ thị có khoảng
pH đổi màu trùng hoặc rất sát với pH của điểm tương đương và dung dịch chuẩn
có nồng độ gần với nồng độ của dung dịch cần xác định. Điều này có nghĩa là, độ
0T = n.100/V
chua Therner là lượng ml NaOH 0,1N dùng trung hòa 100 mL dịch lên men.
b. Thực hiện
Cho 20 mL dịch lên men vào erlen, sau đó cho 80 mL nước đ ể trung hòa, thêm vào đó 2-3 giọt phenolphthalein. Lấy dung dịch chuẩn NaOH 0,1N cho vào buret. Thêm từ từ dung dịch chuẩn đến khi dung dịch lên men từ không màu sang màu hồng phấn bền trong 5 phút thì dừng lại. Ghi lại thể tích NaOH đã dùng.
Khoảng đổi màu của chỉ thị màu phenolphthalein: khi ở pH < 8 sẽ không có màu và sẽ đổi màu đỏ ở pH trên 10.
c. Kết quả Công thức tính độ chua ở mỗi lần thí nghiệm ( trong 100 mL dịch sữa lên men)
Trong đó:
0T: độ chua
n: thể tích NaOH 0,1N sử dụng (mL)
V: thể tích dịch lên men chưa pha loãng (mL)
Thí nghiệm lập lại 3 lần, lấy kết quả trung bình.
❖ Tính lượng acid lactic
Công thức tính lượng acid lactic ( trong 100 mL dịch lên men dựa vào giá trị độ
chua)
Trong đó:
A: khối lượng acid lactic (g)
n: VNaOH 0,1N chuẩn độ (mL)
0,009 : hệ số chuyển 1 mL NaOH 0,1N sang số gam acid lactic
V : thể tích dịch sữa lên men chua lên men (mL)
3.2.3. Quá trình ly tâm thu sinh khối.
- Sau khi chọn được môi trường sản xuất thích hợp cho vi khuẩn
L.sporogenes ta tiến hành ly tâm thu sinh khối vi khuẩn trên môi trường sản xuất
này.
A = 0,009.n.100/V = 0,009.0T
- Ly tâm dịch sinh khối với tốc độ ly tâm 3000 vòng/ phút trong thời gian
20 phút. Sau khi ly tâm ta thu được sinh khối.
- Tiến hành quan sát tế bào trên kính hiển vi, kiểm tra độ nhiễm khuẩn, hình dạng tế bào và đếm số lượng tế bào bằng phương pháp cấy trang trên đĩa MRS ủ 370C/48 giờ, điều kiện yếm khí.