PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật
Từ các nguồn nước biển, bùn biển và rong biển đã thu thập ở trên, chúng tôi tiến hành cấy phân lập các chủng vi sinh vật biển trong môi trường argar-nước biển có bổ sung nguồn carbon là fucoidan thô được chiết từ rong S. mcclurei. Sau từ 3-7
ngày ủ ở nhiệt độ 280C, các khuẩn lạc có khả năng phát triển trên đĩa thạch được chuyển sang đĩa thạch mới.
Hình 2.1: Sơ đồ phân lập vi sinh vật biển.
ủ 3-7 ngày/280C
Nguồn phân lập vi sinh vật
Rong biển Bùn biển, nước biển
Môi trường phân lập M1
Môi trường thạch nghiêng M2
Môi trường bán rắn M3
Lưu trữ ở NITRA
Chọn khuẩn lạc riêng rẽ
Chọn khuẩn lạc thuần ủ 24h/280C
ủ 24h/280C
Ngâm trong nước biển (100ml nước biển + 2g pepton)
Hình 2.2a Hình 2.2b Hình 2.2: Xử lý mẫu rong trước khi phân lập.
(a) Mẫu rong nâu lấy về ngâm trong môi trường nước biển vô trùng (2g pepton/1 l);
(b) Mẫu rong biển sau một tháng, tán rong đã bị phân hủy.
2.2.2. Phương pháp tách chiết enzyme từ vi sinh vật
Chủng vi sinh vật đã phân lập được tiến hành nuôi cấy lắc (150 vòng/ phút, ở nhiệt độ 28-300C, trong 24h), trong môi trường muối khoáng có bổ sung fucoidan sạch (được chiết từ rong S. mcclurei) như là chất cảm ứng vi sinh vật sản xuất enzyme cắt mạch fucoidan.
Canh trường sau khi lên men được ly tâm 20 phút (tốc độ 10.000 vòng/phút) ở 40C. Phần dịch nổi thu lại để thử hoạt tính enzyme (dịch ngoại bào), phần sinh khối tế bào được hòa tan trong đệm acetate 0.01M, pH 5.2 (tỉ lệ V là 1:1). Dịch tế bào sau khi được phá vỡ bằng N2 lỏng trong thời gian 2 phút được nghiền bằng máy siêu âm trong 5 phút ở 00C. Sau đó dịch tế bào được ly tâm trong 20 phút (tốc độ 10.000 vòng/phút) ở 40C. Dịch trong ở trên có chứa enzyme được giữ lại, loại bỏ tủa chứa cặn tế bào rồi thử nghiệm hoạt tính enzyme (dịch nội bào).
Hình 2.3: Sơ đồ nuôi cấy và tách chiết enzyme từ vi sinh vật.
2.2.3Thử nghiệm họat tính enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan
Một hỗn hợp dung dịch gồm 50àl dịch chiết tế bào vi sinh vật được trộn đều với 250àl cơ chất fucoidan 0.5% (pha trong nước) ủ 5 giờ ở 370C. Hoạt tớnh enzyme cắt mạch fucoidan được đánh giá là sự tăng đường khử trong hỗn hợp phản ứng. Nồng độ của đường khử tạo thành được xác định theo phương pháp Nelson- Somogyi[36].
Phần sinh khối
Thử nghiệm hoạt tính enzyme
Phần dịch nổi L1
Ly tâm 10.000rpm/20’/40C Lên men trên môi
trường M4
Phần dịch nổi Ex Phá vỡ màng tế bào bằng N2 lỏng
Ly tâm 10.000 rpm/20’/40C Phá vỡ tế bào bằng
máy nghiền siêu âm
Huyền phù với 1ml đệm acetate 0.01M
pH5.2
Thử nghiệm hoạt tính enzyme
Xác định họat tính fucoidanase
Hoạt tính fucoidanase được xác định theo phương pháp Nelson trên cơ chất fucoidan được chiết từ rong S. mcclurei. Dưới tác dụng của enzyme fucoidanase, fucoidan bị cắt mạch tạo ra oligosaccharide và các đường khử. Vì vậy sự gia tăng lượng đường khử trong hỗn hợp phản ứng sau khi enzyme tác dụng là thước đo hoạt lực enzyme. Nhờ tính chất khử của nhóm (-CHO) của đường khi phản ứng với dung dịch đồng hóa trị 2 tạo thành kết tủa Cu2O. Tủa Cu2O tan trong thuốc thử arseno-molybden, tạo thành phức chất màu xanh da trời và phức này hấp thụ cực đại ở bước sóng 750 nm. Như vậy có thể xác định khả năng phân giải polysaccharide của fucoidanase thông qua hàm lượng Cu phản ứng.
Một đơn vị hoạt tính fucoidanase (U) được định nghĩa là số μM sản phẩm đường khử tạo thành trong 1 đơn vị thời gian (5 giờ ở 370C). Đơn vị hoạt tính enzyme được tính theo công thức sau:
U = X / 180
Trong đó, X: nồng độ fucose; U: đơn vị hoạt tính 1 μmol fucose = 180 μg/ml
Đường chuẩn fucose
y = 0.0105x + 0.0329 R2 = 0.995
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
0 20 40 60 80 100 120
[microgam/ml]
OD750
H
Hììnnhh 22..44:: ĐĐưườờnngg cchhuuẩẩnn ffuuccoossee..
2.2.4 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan
2.2.4.1 Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm đến việc thu nhận sinh khối tế bào
Canh trường sau khi lên men chủng F14 (nuôi lắc 24h, tốc độ lắc 150 vòng/phút, ở 28-300C) được ly tâm với 3.000 vòng/ phút ở 40C. Thu nhận sinh khối tế bào (3.000).
Phần dịch nổi tiếp tục được ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C, thu nhận phần cặn (10.000).
Tiến hành phá vỡ tế bào để thu dịch chiết enzyme như phần 2.2.2.
Thử nghiệm hoạt tính enzyme của các dịch chiết này.
2.2.4.2 Ảnh hưởng của các loại đệm lên hoạt tính enzyme
Sử dụng đệm phosphate 0.01M, pH 7; đệm acetate 0.01M, pH5.2 và đệm phosphate-citrate pH 4.0 để thử nghiệm hoạt tính enzyme.
Hỗn hợp mẫu gồm: 50 àl enzyme +50 àl đệm + 150 àl cơ chất (pha trong đệm). CE: 50 àl enzyme + 200 àl đệm. CS: 100 àl đệm + 150 àl cơ chất ( pha trong đệm). Hỗn hợp phản ứng được ủ trong 5 giờ, ở 370C. Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Nelson-Somogyi [28].
2.2.4.3 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme
Hỗn hợp phản ứng gồm 50 àl dịch chiết enzyme được trộn đều với 250 àl cơ chất fucoidan 0.5%. pH tối ưu của enzyme được xác định bằng cách thử nghiệm hoạt tính ở 370C với đệm acetate 0.1M, pH từ 3.5-8.0.
2.2.4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên họat tính enzyme
Hỗn hợp phản ứng gồm 50 àl dịch chiết enzyme được trộn đều với 250 àl cơ chất fucoidan 0.5%. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme được xác định bằng sự gia tăng lượng đường khử sau khi ủ hỗn hợp enzyme ở nhiệt độ khác nhau (10-700C) trong 5 giờ.