PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Khảo sát điều kiện tách chiết enzyme
Chủng F14 lên men và tiến hành tách chiết enzyme, đồng thời khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme này.
3.3.1. Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm đến việc thu nhận sinh khối tế bào
Sau khi lên men chủng F14 trên môi trường M4, tiến hành ly tâm 3000 vòng/
phút ở 40C trong 20 phút để thu sinh khối tế bào.
Phần dịch nổi tiếp tục ly tâm 10.000 vòng/ phút 40C trong 20 phút để thu phần cặn.
Phá vỡ tế bào như ở phần 2.2.2. Sau đó thử hoạt tính enzyme theo phương pháp Nelson-Somogyi [28]. Kết quả được thể hiện ở bảng dưới đây.
Bảng 3.3: Hoạt tính enzyme khi ly tâm với tốc độ khác nhau.
Tốc độ ly tâm (rpm)
Đơn vị hoạt tính(U) Fucoidan từ
S. mcclurei
Fucoidan từ S. evanescens
3.000 0.421 0.683
10.000 0 0.189
Theo kết quả thu được ở bảng trên ta thấy: ở tốc độ ly tâm 3.000rpm thì cả hai cơ chất là fucoidan từ S.mcclurei và fucoidan từ S.evanescens đều có hoạt tính enzyme cao hơn so với tốc độ ly tâm 10.000rpm. Điều này có thể được giải thích là do khi ly tâm với tốc độ 3.000rpm chỉ có phần sinh khối tế bào lắng xuống đáy, phần dịch bên trên chứa đường, polysaccharide và các thành phần khác. Nên khi ly tâm 10.000rpm thì phần cặn thu được không còn sinh khối tế bào nên không có hoạt tính enzyme.
Như vậy ly tâm với tốc độ 3.000rpm là tốt nhất cho việc thu nhận sinh khối tế bào.
3.3.2. Ảnh hưởng của các loại đệm lên hoạtt tính enzyme
Thử nghiệm hoạt tính enzyme cắt ngắn mạch fucoidan của chủng F14 khi sử dụng 3 loại đệm khác nhau: đệm phosphate 0.01M, pH 7.2; đệm acetate 0.01M, pH 5.2 và đệm phosphate – citrate pH 4.0. Kết quả thu được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của các loại đệm lên hoạt tính enzyme.
Đệm Cơ chất Hoạt tính enzyme
(U: àg/5h) phosphate 0.01M,
pH 7.2
Fucoidan từ
S. mcclurei 0
Fucoidan từ
Fucus evannescens 0.189 acetate 0.01M,
pH 5.2
Fucoidan từ
S. mcclurei 0.524
Fucoidan từ
Fucus evannescens 0.633
phosphate – citrate pH 4.0
Fucoidan từ
S. mcclurei 0
Fucoidan từ
Fucus evannescens 0
Theo bảng 3.4 ta thấy rằng: đối với fucoidan từ Fucus evannescens thì enzyme có hoạt tính trên cả đệm phosphate 0.01M, pH 7.2 và đệm acetate 0.01M, pH 5.2. Nhưng đối với fucoidan từ S. mcclurei thì enzyme chỉ có hoạt tính khi sử dụng đệm acetate 0.01M, pH 5.2.
Do đó chúng tôi sử dụng đệm acetate 0.01M, pH 5.2 để tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme.
3.3.3. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme
pH tối ưu cho họat động của enzyme được xác định bằng cách thử nghiệm hoạt tính ở 370C với đệm acetate 0.01M, pH từ 3.5-8.0
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme.
pH 3.5 4 5 6 7 8
Đơn vị hoạt tính(U)
Fucoidan từ Fucus evannescens
0 0.001 0.695 0.483 0.104 0 Fucoidan từ
S. mcclurei 0 0.106 0.856 0.747 0.017 0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
3.5 4 5 6 7 8
pH
Fucoidan Fucus evannescens Fucoidan S.mcclurei
Hình 3.2: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme.
Từ số liệu thu được trên bảng 3.5 và hình 3.1, chúng tôi có nhận xét sau:
Hoạt tính của enzym trên 02 loại fucoidan hoạt động trong khoảng pH từ 4 đến 7 và hoạt động mạnh tại pH trong khoảng (5-6). Như vậy khả năng sinh tổng hợp fucoidanase không dao động mạnh (97-100%) trong khoảng pH 5-6 và đạt cực đại ở pH 5.0 (0.696U).
So sánh hoạt tính của enzym trên 02 loại fucoidan khác nhau thì hoạt tính của enzyme trên cơ chất fucoidan từ S. mcclurei lớn hơn fucoidan từ Fucus evannescens. Sự khác nhau này có thể là do cấu trúc khác nhau của hai loại fucoidan này, fucoidan của rong Fucus evannescens có thành phần chủ yếu là fucose (87%) và fucoidan này có mạch chính là fucose-fucose, trong khi đó
đơn vị hoạt tính
fucoidan của rong S. mcclurei ngoài fucose (50,51%) còn chứa nhiều thành phần khác như glucose, galactose, mannose… và mạch chính là fucose-fucose-galactose.
3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme được xác định bằng sự gia tăng đường khử sau khi ủ hỗn hợp enzyme ở những nhiệt độ khác nhau (10-700C).
Hỗn hợp phản ứng gồm 50 àl enzyme với 250 àl cơ chất fucoidan 0.5%
được ủ 5 giờ ở các nhiệt độ khác nhau. Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Nelson-Somogyi [28]. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme.
Nhiệt độ (0C) 10 20 30 40 50 60 70
Đơn vị hoạt
tính (U)
Fucoidan từ Fucus evannescens
0.312 0.636 1.091 1.032 0.053 0 0
Fucoidan từ
S. mcclurei 0.445 0.694 1.323 1.288 0.106 0.017 0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
10 20 30 40 50 60 70 nhiệt độ (độ C)
đơn vị hoạt tính (U)
Fucoidan từ Fucus evanescens
Fucoidan từ S,mcclurei
Hình 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme.
Nhận xét:
Ở nhiệt độ nuôi cấy thấp 200C, hoạt tính enzyme chỉ bằng một nửa so với nhiệt độ tối ưu. Ở 300C, fucoidanase được tổng hợp tối đa với hoạt tính đạt 1.091U (100%). ở 400C khả năng sinh tổng hợp fucoidanase bị ảnh hưởng đáng kể hoạt tính giảm còn 95%. Khi khảo sát tại nhiệt độ 500C thì họat tính fucoidanase giảm rất mạnh hoạt tính chỉ bằng 6% so với nhiệt độ 300C. Như vậy nhiệt độ tối ưu cho sự hoạt động của enzyme cắt mạch fucoidan chiết từ chủng F14 nằm trong khoảng 30- 40oC.
Kết quả chúng tôi thu được có sai khác so với công trình của một số nhà khoa học Nhật Bản khi nghiên cứu các enzyme cắt mạch fucoidan từ một số loài sinh vật biển, các vi sinh vật biển của họ có enzyme hoạt động tối ưu là 30- 350C[42]. Như vậy, enzyme có khả năng cắt mạch fucoidan của nước ta có khoảng hoạt động nhiệt độ rộng hơn so với thế giới.
Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme cắt mạch fucoidan lên hai loại cơ chất là tương tự nhau. Tuy nhiên hoạt tính trên cơ chất fucoidan Fucus evannescens thấp hơn fucoidan S. mcclurei. Điều này được giải thích là do cấu trúc khác nhau của hai loại fucoidan này, fucoidan của rong Fucus evannescens có mạch chính là fucose-fucose thông qua liên kết (1-2) glycosit và sunphate hóa tại vị trí C2 hoặc C3, trong khi đó fucoidan của rong S.mcclurei có mạch chính là fucose-fucose-galactose thông qua liên kết (1-3)glycosit, và sunphate hóa tại vị trí C4.
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ