Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme được xác định bằng sự gia tăng đường khử sau khi ủ hỗn hợp enzyme ở những nhiệt độ khác nhau (10-700C).
Hỗn hợp phản ứng gồm 50 µl enzyme với 250 µl cơ chất fucoidan 0.5% được ủ 5 giờ ở các nhiệt độ khác nhau. Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Nelson-Somogyi [28]. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.6: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme.
Nhiệt độ (0C) 10 20 30 40 50 60 70 Đơn vị hoạt tính (U) Fucoidan từ Fucus evannescens 0.312 0.636 1.091 1.032 0.053 0 0 Fucoidan từ S. mcclurei 0.445 0.694 1.323 1.288 0.106 0.017 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 10 20 30 40 50 60 70 nhiệt độ (độ C) đơ n vị h oạ t t ín h (U ) Fucoidan từ Fucus evanescens Fucoidan từ S,mcclurei
Nhận xét:
Ở nhiệt độ nuôi cấy thấp 200C, hoạt tính enzyme chỉ bằng một nửa so với nhiệt độ tối ưu. Ở 300C, fucoidanase được tổng hợp tối đa với hoạt tính đạt 1.091U (100%). ở 400C khả năng sinh tổng hợp fucoidanase bị ảnh hưởng đáng kể hoạt tính giảm còn 95%. Khi khảo sát tại nhiệt độ 500C thì họat tính fucoidanase giảm rất mạnh hoạt tính chỉ bằng 6% so với nhiệt độ 300C. Như vậy nhiệt độ tối ưu cho sự hoạt động của enzyme cắt mạch fucoidan chiết từ chủng F14 nằm trong khoảng 30- 40oC.
Kết quả chúng tôi thu được có sai khác so với công trình của một số nhà khoa học Nhật Bản khi nghiên cứu các enzyme cắt mạch fucoidan từ một số loài sinh vật biển, các vi sinh vật biển của họ có enzyme hoạt động tối ưu là 30- 350C[42]. Như vậy, enzyme có khả năng cắt mạch fucoidan của nước ta có khoảng hoạt động nhiệt độ rộng hơn so với thế giới.
Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme cắt mạch fucoidan lên hai loại cơ chất là tương tự nhau. Tuy nhiên hoạt tính trên cơ chất fucoidan Fucus evannescens
thấp hơn fucoidan S. mcclurei. Điều này được giải thích là do cấu trúc khác nhau của hai loại fucoidan này, fucoidan của rong Fucus evannescens có mạch chính là fucose-fucose thông qua liên kết (1-2) glycosit và sunphate hóa tại vị trí C2 hoặc C3, trong khi đó fucoidan của rong S.mcclurei có mạch chính là fucose-fucose-galactose thông qua liên kết (1-3)glycosit, và sunphate hóa tại vị trí C4.
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận
Sau quá trình phân lập và sàng lọc khả năng sinh enzyme phân cắt fucoidan của các chủng vi sinh vật biển, chúng tôi đã thu được một số kết quả sau:
Đã phân lập được 24 chủng vi sinh vật trong đó có 6 chủng nấm mốc và 19 chủng vi khuẩn từ các nguồn nước biển, bùn biển và rong nâu ở vùng biển Khánh Hòa.
1. Đã sang lọc được 4 chủng vi khuẩn có khả năng cắt mạch fucoidan. Trong đó chủng F14 có khả năng bẻ gãy mạch fucoidan chiết từ rong s.mcclurei là cao nhất.
2. Từ môi trường lên men lỏng nuôi cấy chủng F14, li tâm với tốc độ 3.000rpm/20 phút ở 40C là tốt nhất.
3. Enzyme cắt mạch Fucoidan của chủng F14 hoạt động tốt khi sử dụng đệm acetate 0,01M pH 5,2.
4. pH hoạt động tối ưu của enzyme phân cắt fucoidan chiết từ chủng F14 là 5-6.
5. Nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzyme phân cắt fucoidan chiết từ chủng F14 là 30-400C.
4.2. Kiến nghị
1. Định danh chủng F14.
2. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng vi khuẩn F14 để chúng sản xuất enzyme cắt mạch fucoidan cao.
3. Tinh sạch enzyme cắt mạch fucoidan của chủng F14. 4. Nghiên cứu sâu hơn động học của enzyme.
5. Sử dụng enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan để điều chế oligofucan sulphate hóa.
PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần môi trƣờng M1 Nước biển 1000 ml Agar-agar 20 g Fucoidan thô 2g Phụ lục 2: Thành phần môi trƣờng M2 Nước biển 750 ml Nước máy 250 ml K2HPO4 0,1 g MgSO4.5H2O 0,1 g Peptone 10 g Saccarose 5g Agar 15g Phụ lục 3: Thành phần môi trƣờng M3 Nước biển 750 ml Nước máy 250 ml K2HPO4 0,1 g MgSO4.5H2O 0,1 g Peptone 10 g Saccarose 5g Agar 3g Phụ lục 4: Thành phần môi trƣờng M4 Nước biển 250 ml Nước máy 750 ml
K2HPO4 0,1 g MgSO4.5H2O 0,1 g Bacto pepton 10 g Fucoidan sạch 10 mg
Phụ lục 5: Cách pha hóa chất cho phƣơng pháp Nelson
+ Thuốc thử Nelson A: Na2CO3 25g KNaC4H8O6.4H2O 23 g NaHCO3 20 g Na2SO4 20 g Định mức đủ 1 lít + Thuốc thử Nelson B: CuSO4.5H2O 15 g H2SO4 đậm đặc 1-2 giọt Định mức đủ 100 ml + Thuốc thử Nelson C: Dung dịch 1 gồm: NH4Mo7O24.4H2O 33 g H2O 600 ml Dung dịch 2 gồm: Na2HAsO4 9,4 g H2O 50 ml
Trộn dung dịch 1 với 42 ml H2SO4 đậm đặc, sau đó thêm dung dịch 2, khuấy đều, đưa lên mức 1 lít bằng nước cất và đặt ở 37o
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng việt
[1] Bùi Minh Lý (2006), “Nghiên cứu công nghệ và thiết bị sản xuất Fucoidan qui mô pilot từ một số loài rong Nâu Việt Nam”, Báo cáo kết quả nghiên cứu khoa học công nghệ, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang
[2] Bùi Minh Lý (2008), “Nghiên cứu công nghệ và thiết bị sản xuất Fucoidan từ một số loài rong Nâu Việt Nam”, Báo cáo tổng kết đề tài, Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang.
[3] Dặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thị Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm, Công Nghệ Enzym, Nhà Xuất Bản Khoa Học Và Kỹ Thuật Hà Nội
[4] Nguyễn Duy Nhứt, Bùi Minh Lý, Nguyễn Mạnh Cường, Trần Văn Sang (2007), Tạp chí Hóa học, tập 45, số 3, trang 339-342.
[5] Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến, Công Nghệ Enzym, Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh.
[6] Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa, Chế biến rong biển, Giáo trình Đại học Nha Trang.
Tiếng anh
[7] Bakunina, I.Y., O.I. Nedashkov Shaia, S. A. Alekseeva, E. P. Ivanova, L.A. Romanenko, N. M. Gorshkova, V. V. Isakov, T.N. Zvyagintseva, and V.V. Mikhailov (2002), “Degradation of Fucoidan by the marine proteobacterium
Pseudoalteromonas citrea”, Microbiology, 71, 41-47.
[8] Berteau O., McCort I., Goasdoue N. et al.,(2002), “Characterization of a new -L-fucosidase isolated from the marine mollusk Pecten maximus hat catalyzes the hydrolysis of -L-fucose from Ascophylum nodosum”,
[9] Berteau O., Mulloy B. (2003), “Sulfated fucans and an overview of enzimes active toward this Review”, Glycobiology B, Vol. 13, N.6, 26R-40R.
[10] Berteau O., Mulloy B., (2003), “Sulfated fucans, fresh perspectives. Structures, functions, and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzyms active toward this class of polysaccharide”, Glycobiology, 13, 29R-40R.
[11] Bilan M. I., Grachev A. A. and Usov A. I. (2004), A highly regular fraction of a Fucoidan from the brown seaweed Fucus distinchus, Carbonhydr. Res., 339, 511-517.
[12] Bilan M. I., Kusaykin M. I., Zvyagintseva T. N. et al. (2005), “Deistvie ferenzymtnovo preparata iz morskovo molliuska Littorina kurila na Fucoidan iz buroi vodorosli Fucus distichus”, Biokhimiya, 70, N.6, P. 328-338.
[13] Bo Li, Fei Lu, Xịnin Wei and Ruixiang Zhao (2008), “Fucoidan: Structure and Bioativity”, Molecules- 13, 1671-1695.
[14] Burtseva Y. V, Kusaykin M. I, Sova V. V, et al.(2000), “Distribution of Fucoidan hydrolases and some glycosidases among marine invertebrates”,
Russ. J. Mar. Biol., 26, 453-456.
[15] Huynh QN, Nguyen HD (1998) “The seaweed resources of Vietnam”, In: Critchley AT, Ohno M (eds) Seaweed resources of the world. JICA. Pp 62– 69.
[16] Daisuke Tachikawa, Masaji Nakamizo, Makoto Fujii, Anti-Turmo Activity and Enhancement of NK Cell Activity by Fucoidan, 12th International Congress of Immunology and 4th Annual Conference of FOCIS, 2004.
[17] Daniel R., Berteau O., Chevolot L. et al. (2001), “Regiose lective desulfatation of sulfated L-fucopyranoside by a new sulfoesterase from the marine mollusk
Pecten maximus: application to the structrural study of algal Fucoidan (A. nodosum)”, Eur. J. Biochem, 4, 55-62.
[18] Daniel R., Berteau O., Jozefonvicz J., et al. (1999), “Degradation of algal (Ascophyllum nodosum) Fucoidan by an enzymatic activity contained in digestive glands of the marine mollusk Pecten maximus”, Carbonhyd. Res., 322, 291-297.
[19] Dararad Choosawad, Ureporn Leggat, Chavaboon Dechsukhum, Amornrat Phongdara and Wilaiwan Chotigeat (2005), “Anti-turn our activities of Fucoidan from aquatic plant Utricularia aurea lour”, SongklanakarinJ.Sei. Technol., 27, 779-807.
[20] Descamps V., Klarszinsky O., Barbeyron J. et al. (1998), “Fuco- oligosaccharides, enzym pour leur preparation a partir de fucanes, bacterie productricede l’enzym et application des fuco-oligosaccharides a la protection des plantes”, Brevet, FR 2783523.
[21] Dobashi, K.; Nishino, T.; Fujihara, M. (1989), “Isolation and preliminary characterization of fucose-containing sulfated polysaccharides with blood- anticoagulant activity from seaweed Hizikia fusiforme”, Carbohydr. Res., 194, 315-320.
[22] Ellouali M., Boisson-Vidal C., Durand P. et al. (1993), “Antitumour activity of low molecular weight fucans extracted from brown seaweed Ascophylum nodosum”, Anticancer Res., 13, 2011-2019.
[23] Furukawa S, Fujikawa T, Koga D, Ide A (1992), “Production of Fucoidan- degrading enzyms, Fucoidanase and Fucoidan sulfatase by Vibrio sp. N-5”,
Nippon Suisan Gakkaishi, 58, 1499–1503.
[24] Furukawas and Fujikawa T. (1984), “Growth and Fucoidan sulfatase production in Fucoidan-utilizing bacteria from sea sand, Nippom Nogeik Kaishi, 11, 1123-1126.
[25] Kim, Woo-Jung, Sung-Min Kim and et, “Isolation and characteriazation of marine bacteria strains degrading Fucoidan from korea Undaria pinnatifida sporophylls”. J.Microbiol. Biotechol.
[26] Kitamura K, Matsuo M, Yasui T (1992), “Enzymic degradation of Fucoidan by Fucoidanase from the hepatopancreas of Patinopecten yessoensis”, Biosci Biotechnol Biochem, 56, 490–494
[27] Kloareg, B., Dematry, M., and Mbeau, S (1986), “Polyanionic characteristic of furified sulphated homofucans from brown algae”. Int.J.Bio Macromol-8,pp 380-386.
[28] Kobayashi T, Honke K, Miyazaki T, Matsumota K, Nakamura T, Ishizuka I, Makita A (1994), “Hepatocyte growth factor (HGF) specifically binds to sulfoglycolipids”, J.Biol chem-269, pp9817-9821
[29] L.loyd P. F., Lloyd K. O. (1963), “Sulfatases and sulfated polysaccharide in the vicera of marine mollusk”, Nature, 199, 287-288.
[30] Maria E.R. Duarte,a Marc A. Cardoso,a Miguel D. Noseda,a,1 Alberto S. Cerezo (2001), “Structural studies on Fucoidans from the brown seaweed
Sargassum stenophyllum”,Carbohydrate Research 333, pp 281–293
[31] Maria I. Bilan, Alexey A. Grachev, Alexander S. Shashkov, Nikolay E, Nifantiev and Anatolii I. Usov (2006) “Structure of a Fucoidan from the brown seaweed Fucus serratus L”, Carbohydrate Research 341, pp 238-245
[32] Maruyama, Hiroko, Tâmuchi, Hidekazu; Hashimota, Minoru; Makano, Takahisa (2003), “Antitumor activity and immune response of Mekabu Fucoidan extracted from sporophyll of Undaria pinnatifida”, In Vivo, 17(3), 245-249.
[33] Merrill JE, Waaland JR (1998), “The seaweed resources of the United State of America”. In: Seaweed resources of the world. JICA, pp. 303-323.
[34] Morigana T, Araki T, Ito M, Kitamikado M (1981), “A search for Fucoidan- degrading bacteria in coastal sea environments of Japan”, Bull Jpn Soc Sci Fish, 47, 621–625.
[35] Mülheim an der Ruhr (2009), “Isolation, Characterisation, Modification an Application of Fucoidan from Fucus vesiculosu”.
[36] Nelson TE (1944),“A photometric adaptation of the Somogy method for the determination of glucose”, J. Biol. Chem. 153: 375–381.
[37] Nishino, T.; Yokoyama, G.; Dobahi, K. (1989), “Isolation, purification and characterization of fucose-containing sulfated polysaccharides from the brown seaweed Ecklonia kurome and their blood-anticoagulant activities”,
Carbohydr. Res., 186, 119-129.
[38] Ohno M., A. T. Critchley (1997), “Seaweed cultivation and marine ranching”,
Bull. Mar. Sci. Fish
[39] Pearce-Pratt R, et al.(1996), “Sulfated polysaccharides inhibit lymphocyte to epithelial transmissio of human immunodeficiency virus”, Biological Reproduction, 54, 173-82.
[40] Ponce, N.M.A.; Pujol, C.A.; Damonte, E.B. (2003), “Fucoidans from the brown seaweed Adenocystis utricularis: extraction methods, antiviral activity and structural studies”. Carbohydr. Res., 338, 153-165.
[41] Régis Daniel, Olivier Berteau, Jacqueline Jozefonvicz and Nicole Goasdoue (1999), “Degradation of algal (Ascophyllum nodosum) Fucoidan by an enzymatic activity cantained in digestive glands of the marine mollusc Pecten maximus”, Carbohydtate Research, Volume 322, Issues 3-4, 12 December, pp 291-297
[42] Rita Elkins M.H (2001), “Limu Moui-prize sea plant of tonga and the south pacific”, Woodland Publishing-Utah-USA 32 pagine
[43] Rosa María Rodríguez Jasso 1, Cristobal Noé Aguilar Gonzalez 2, Lorenzo Pastrana 3, Jose A. Couto Teixeira 1, “Identification and evaluation of fungal strains with Fucoidan degradation potential”, Proceedings of the 10th
International Chemical and Biological Engineering Conference - CHEMPOR 2008.
[44] Sakai T, Ishizuka K, Kato I (2003b), “Isolation and characterization of a Fucoidan-degrading marine bacterium”, Mar Biotechnol 5, 409–416.
[45] Sakai, T.; Kawai, T.; Kato, I. (2004), “Isolation and characterization of a Fucoidan-degrading marine bacterial strain and its Fucoidanase”, Mar. Biotechnol, 6, 335-346.
[46] Tanaka K., Sorai S. (1970), “Hydrolysis of Fucoidan by abalone liver α-L- fucoisidase”, FEBS Lett., 9, 45-48
[47] Vedrenge M. Erlandsson-Harris H. Tarkowski A (2000), “Role of selectins in experimental Staphylococcus aureus-induced arthritis” European Journal of Immunology-30, pp 1606-1613.
[48] W.A.P.Black (1952), “Laboratory - Scale Isolation of Fucoidin from Brown Marine Algae”, J.Sci.Fd.Agric, pp3-122.
[49] Yaphe W., and Morgan K. (1959), “Hydrolysis of fucoidin by Pseudomonas atlantica and Pseudomonas carrageenova”, Nature, 463, 761-762
[50] Yu. Bakunina, L. S. Shevchenko, O. I. Nedashkovskaya, N. M. Shevchenko, S. A. Alekseeva, V. V. Mikhailov, and T. N. Zvyagintseva (2000), “Screening of Marine Bacteria for Fucoidanases”, Microbiolog 3; Vol. 69, No. 3, pp. 303- 308
[51] Zhuang, Cun; Itoh, Hiroko, Mizono, Takashi Ito, Hitoshi (1995), “Antimor active Fucoidan from the brown seaweed, Umitoranoo (Aargassum thunbergii)”, Biosci Biotech Bi, , 9, 563-567.