Vi sinh vật biển là nguồn chứa các hoạt chất có hoạt tính sinh học nhiều triển vọng, trong đó bao gồm các enzyme quý hếm. Khi bị phân hủy rong sẽ trở thành đối tượng tấn công của các vi sinh vật mà hệ enzyme của chúng có khả năng bẻ ngắn mạch polysaccharide về mono- và oligosaccharide. Vì vậy mà những năm gần đây các nhà khoa học trên thế giới bắt đầu nghiên cứu về vi sinh vật biển sinh enzyme phân cắt fucoidan. Một số kết quả đã được công bố tuy nhiên các kết quả này vẫn chỉ ở mức quy mô phòng thí nghiệm, chưa được đưa ra thị trường. Dưới đây là một số kết quả tổng hợp trên thế giới. (bảng 1.3).
Bảng 1.3: Vi sinh vật biển và enzym của chúng [35].
STT Họ Giống Loài Chủng Nguồn PL Enzym
Loại pHotp Totp (oC)
1 Vibrionacace Vibrio n.s N-5 Cát biển Fucoidanase 6,0 40
fucosulfatase 7,5
2 Alteromonadaceae
n.s n.s n.s Nước biển ven
bờ Endosulfated fucan-degesting 6,5-8 30-35 pseudoalteromonas P.citrea KMN 3296 Focus evenescens
Thủy phân liên
kết O-glycosidic n.s <50
KMN 3297 Apostichopus
japonicus n.s n.s <50
KMN 3298 Corda filum n.s n.s <40
Saccharophagus S.degradans 2-40 Spartina
alterniflora n.s. n.s. n.s.
3 Flavobacteriaceae
Marini flexile
fucanivorans n.s. SW 5 Cây xử lý nước n.s. 7.5 20-25 °C
Gramella n.s. KMM 6054 Strongylocentr otus intermedius n.s. n.s. n.s. Maribacter M. algae n.s. Acrosiphonia sonderi n.s n.s. n.s. KMM 621 S. intermedius n.s. n.s. n.s.
4 Melanconiaceae Hyphomycete Dendryphiella
arenaria TM 94 Cát biển
Exo-and endotype hydrolysis
6.0 50 °C
5 Sphingomonaceae Sphingomonas Sphingomona
s sp. PF-1 Nước biển Fucoidanase
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Chủng giống
Các chủng vi sinh vật biển được phân lập từ các mẫu nước biển, bùn biển và rong biển được thu tại Bãi Cạn (12012’30’’ – vĩ độ Bắc, 109013’30’’ – kinh độ Đông) thuộc vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa. Các mẫu rong thu được gồm các loài S. mcclurei, S. microcystum, S. polycystum, S. seratum.
Ngoài ra chúng tôi sử dụng fucoidan chiết từ loài rong S. mcclurei thuộc ngành rong nâu để nghiên cứu. Đây là loài rong phổ biến, có trữ lượng lớn và thành phần đường fucose khá cao (50,51%) nên đã được chọn làm nguồn carbon để phân lập vi sinh vật, đồng thời là cơ chất để thử hoạt tính enzyme. Bên cạnh đó chúng tôi sử dụng fucoidan từ rong Fucus evanesces là loại fucoidan có hàm lượng fucose cao (87%) để làm cơ chất cho các thử nghiệm hoạt tính enzyme nhằm so sánh các kết quả.
Bảng 2.1: Thành phần hóa học của một số loại fucoidan [4].
Rong Thành phần đƣờng của Fucoidan SO3Na Acid (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
uronic
Fuc Xyl Man Glu Gal Rha w/w %
S. microcystum 28.9 6.94 11.27 9.83 30.35 12.72 26.69 21.20
S. polycystum 35.9 6.8 9.6 4.9 33.1 - 25.6 17.87
S. mcclurei 50.51 2.53 12.12 4.04 5.56 25.25 33.15 17.87
Fucus evanesces 87 10 0 0 1 - - -
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật
Từ các nguồn nước biển, bùn biển và rong biển đã thu thập ở trên, chúng tôi tiến hành cấy phân lập các chủng vi sinh vật biển trong môi trường argar-nước biển có bổ sung nguồn carbon là fucoidan thô được chiết từ rong S. mcclurei. Sau từ 3-7
ngày ủ ở nhiệt độ 280C, các khuẩn lạc có khả năng phát triển trên đĩa thạch được chuyển sang đĩa thạch mới.
Hình 2.1: Sơ đồ phân lập vi sinh vật biển.
ủ 3-7 ngày/280C
Nguồn phân lập vi sinh vật
Rong biển Bùn biển, nước biển
Môi trường phân lập M1
Môi trường thạch nghiêng M2
Môi trường bán rắn M3 Lưu trữ ở NITRA Chọn khuẩn lạc riêng rẽ Chọn khuẩn lạc thuần ủ 24h/280 C ủ 24h/280C
Ngâm trong nước biển (100ml nước biển + 2g pepton)
Hình 2.2a Hình 2.2b
Hình 2.2: Xử lý mẫu rong trước khi phân lập.
(a) Mẫu rong nâu lấy về ngâm trong môi trường nước biển vô trùng (2g pepton/1 l); (b) Mẫu rong biển sau một tháng, tán rong đã bị phân hủy.
2.2.2. Phương pháp tách chiết enzyme từ vi sinh vật
Chủng vi sinh vật đã phân lập được tiến hành nuôi cấy lắc (150 vòng/ phút, ở nhiệt độ 28-300C, trong 24h), trong môi trường muối khoáng có bổ sung fucoidan sạch (được chiết từ rong S. mcclurei) như là chất cảm ứng vi sinh vật sản xuất enzyme cắt mạch fucoidan.
Canh trường sau khi lên men được ly tâm 20 phút (tốc độ 10.000 vòng/phút) ở 40C. Phần dịch nổi thu lại để thử hoạt tính enzyme (dịch ngoại bào), phần sinh khối tế bào được hòa tan trong đệm acetate 0.01M, pH 5.2 (tỉ lệ V là 1:1). Dịch tế bào sau khi được phá vỡ bằng N2 lỏng trong thời gian 2 phút được nghiền bằng máy siêu âm trong 5 phút ở 00C. Sau đó dịch tế bào được ly tâm trong 20 phút (tốc độ 10.000 vòng/phút) ở 40C. Dịch trong ở trên có chứa enzyme được giữ lại, loại bỏ tủa chứa cặn tế bào rồi thử nghiệm hoạt tính enzyme (dịch nội bào).
Hình 2.3: Sơ đồ nuôi cấy và tách chiết enzyme từ vi sinh vật. 2.2.3Thử nghiệm họat tính enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan
Một hỗn hợp dung dịch gồm 50µl dịch chiết tế bào vi sinh vật được trộn đều với 250µl cơ chất fucoidan 0.5% (pha trong nước) ủ 5 giờ ở 370C. Hoạt tính enzyme cắt mạch fucoidan được đánh giá là sự tăng đường khử trong hỗn hợp phản ứng. Nồng độ của đường khử tạo thành được xác định theo phương pháp Nelson- Somogyi[36]. Phần sinh khối Thử nghiệm hoạt tính enzyme Phần dịch nổi L1 Ly tâm 10.000rpm/20’/40 C Lên men trên môi
trường M4 Phần dịch nổi Ex Phá vỡ màng tế bào bằng N2 lỏng Ly tâm 10.000 rpm/20’/40C Phá vỡ tế bào bằng
máy nghiền siêu âm Huyền phù với 1ml đệm acetate 0.01M pH5.2 Thử nghiệm hoạt tính enzyme
Xác định họat tính fucoidanase (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hoạt tính fucoidanase được xác định theo phương pháp Nelson trên cơ chất fucoidan được chiết từ rong S. mcclurei. Dưới tác dụng của enzyme fucoidanase, fucoidan bị cắt mạch tạo ra oligosaccharide và các đường khử. Vì vậy sự gia tăng lượng đường khử trong hỗn hợp phản ứng sau khi enzyme tác dụng là thước đo hoạt lực enzyme. Nhờ tính chất khử của nhóm (-CHO) của đường khi phản ứng với dung dịch đồng hóa trị 2 tạo thành kết tủa Cu2O. Tủa Cu2O tan trong thuốc thử arseno-molybden, tạo thành phức chất màu xanh da trời và phức này hấp thụ cực đại ở bước sóng 750 nm. Như vậy có thể xác định khả năng phân giải polysaccharide của fucoidanase thông qua hàm lượng Cu phản ứng.
Một đơn vị hoạt tính fucoidanase (U) được định nghĩa là số μM sản phẩm đường khử tạo thành trong 1 đơn vị thời gian (5 giờ ở 370C). Đơn vị hoạt tính enzyme được tính theo công thức sau:
U = X / 180
Trong đó, X: nồng độ fucose; U: đơn vị hoạt tính 1 μmol fucose = 180 μg/ml
Đường chuẩn fucose
y = 0.0105x + 0.0329 R2 = 0.995 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 20 40 60 80 100 120 [microgam/ml] O D 7 5 0 H Hììnnhh22..44::ĐĐưườờnnggcchhuuẩẩnnffuuccoossee..
2.2.4 Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng lên hoạt tính enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan
2.2.4.1 Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm đến việc thu nhận sinh khối tế bào
Canh trường sau khi lên men chủng F14 (nuôi lắc 24h, tốc độ lắc 150 vòng/phút, ở 28-300C) được ly tâm với 3.000 vòng/ phút ở 40C. Thu nhận sinh khối tế bào (3.000).
Phần dịch nổi tiếp tục được ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 20 phút ở 40
C, thu nhận phần cặn (10.000).
Tiến hành phá vỡ tế bào để thu dịch chiết enzyme như phần 2.2.2. Thử nghiệm hoạt tính enzyme của các dịch chiết này.
2.2.4.2 Ảnh hưởng của các loại đệm lên hoạt tính enzyme
Sử dụng đệm phosphate 0.01M, pH 7; đệm acetate 0.01M, pH5.2 và đệm phosphate-citrate pH 4.0 để thử nghiệm hoạt tính enzyme.
Hỗn hợp mẫu gồm: 50 µl enzyme +50 µl đệm + 150 µl cơ chất (pha trong đệm). CE: 50 µl enzyme + 200 µl đệm. CS: 100 µl đệm + 150 µl cơ chất ( pha trong đệm). Hỗn hợp phản ứng được ủ trong 5 giờ, ở 370C. Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Nelson-Somogyi [28].
2.2.4.3 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme
Hỗn hợp phản ứng gồm 50 µl dịch chiết enzyme được trộn đều với 250 µl cơ chất fucoidan 0.5%. pH tối ưu của enzyme được xác định bằng cách thử nghiệm hoạt tính ở 370C với đệm acetate 0.1M, pH từ 3.5-8.0.
2.2.4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên họat tính enzyme
Hỗn hợp phản ứng gồm 50 µl dịch chiết enzyme được trộn đều với 250 µl cơ chất fucoidan 0.5%. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme được xác định bằng sự gia tăng lượng đường khử sau khi ủ hỗn hợp enzyme ở nhiệt độ khác nhau (10-700C) trong 5 giờ.
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập các chủng vi sinh vật biển theo định hƣớng sinh enzyme cắt ngắn mạch fucoidan mạch fucoidan
Do sự đa dạng rộng lớn của điều kiện sống mà các vi sinh vật biển được coi là những nguồn các hợp chất có hoạt tính sinh học đầy tiềm năng và nhiều triển vọng, bao gồm các enzyme quý hiếm. Một số vi sinh vật biển có khả năng bẻ ngắn mạch polysaccharide không tan trong nước như kitin, agar cũng như các polysaccharide trong thành tế bào rong biển. Khi bị tổn hại trong quá trình bảo tố, rong nâu trở thành đối tượng tấn công của các vi sinh vật thủy sinh và các vi sinh vật này có hệ enzyme có khả năng bẻ ngắn mạch polysaccharide tồn tại trong thành tế bào rong về dạng mono và oligosaccharide. Các saccharide này được sử dụng không chỉ cho bản thân các vi sinh vật kí sinh ngoài, mà cho cả các vi sinh vật biển khác. Các glycosidase thường được sinh bởi các vi sinh vật cộng sinh, ví dụ như vi sinh vật thuộc chi Vibrio gắn với rong nâu Laminaria longicruris có khả năng thủy phân laminaran, trong khi đó vi sinh vật phân lập từ rong đỏ Polisophonia lanosa, Hupnea charoides và Gracilaria gracilis có khả năng thủy phân agar [50]. Như vậy, có thể cho rằng rong biển là một nguồn các chất dinh dưỡng cho các vi sinh vật ký sinh ngoài.
Dựa trên cơ sở tham khảo các tài liệu như đã trình bày trên, chúng tôi tiến hành phân lập vi sinh vật bẻ ngắn mạch fucoidan từ các nguồn rong nâu, nước biển và bùn biển nơi mà rong sinh sống. Sử dụng môi trường M1 với nguồn carbon duy nhất là fucoidan từ S. mcclurei để làm môi trường phân lập. Đây là môi trường phân lập có tính chọn lọc, vì vậy chủng vi sinh vật nào mọc được trên môi trường này thì có khả năng sinh enzym phân cắt fucoidan tạo nguồn dinh dưỡng cho bản thân vi sinh vật. Kết quả chúng tôi thu được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.1: Các chủng vi khuẩn biển đã phân lập đƣợc.
STT Nguồn phân lập Kí hiệu
chủng Đặc điểm khuẩn lạc 1 Rong S. seratum (3 chủng) F1 Khuẩn lạc trắng, nhầy, bóng 2 F2 Khuẩn lạc trắng, tròn, có nhân 3 F3 Khuẩn lạc vàng, tròn, bóng 4 Rong S. mcclurei (3 chủng)
F4 Khuẩn lạc trắng sữa, nhầy, bóng
5 F5 Khuẩn lạc trắng, tròn, lồi
6 F14 Khuẩn lạc trắng sữa, trơn, bóng,
tròn, đường kính 1mm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
7 Nước biển
(3 chủng)
F6 Khuẩn lạc trắng sữa, tròn, viền vàng 8 F7 Khuẩn lạc trắng sữa, dẹt 9 F8 Khuẩn lạc tròn, dẹt, vàng nhạt 10 Bùn biển (3 chủng) F9 Khuẩn lạc vàng, dẹt, viền trắng 11 F10 Khuẩn lạc trắng, bóng, lồi 12 F11 Khuẩn lạc trắng trong, tròn, đục 13 Rong S. microcystum (3 chủng) F12 Khuẩn lạc trắng, nhầy bóng
14 F13 Khuẩn lạc trắng sữa, trơn, bóng,
tròn, đường kính 2mm
15 Rong S. polycystum
(2 chủng)
F15 Khuẩn lạc tròn, lồi, vàng nhạt, có viền sang xung quanh
16 F16 Khuẩn lạc dẹt, bóng, trắng trong,
hình bầu dục 17 Nước chiết fucoidan để lâu
ngày (5 chủng) F17 Mốc đen 18 F18 Mốc vàng nâu 19 F19 Mốc xanh 20 F20 Mốc đen, viền trắng 21 F21 Mốc nâu
22 Rong Nâu tàn lụi không
xác định được loài (3 chủng)
F22 Mốc vàng
23 F23 Mốc vàng ở giữa, viền trắng
Chúng tôi đã phân lập được 24 chủng vi sinh vật biển bao gồm cả nấm mốc và vi khuẩn, mặc dù được phân lập trên môi trường giống nhau nhưng khuẩn lạc có hình dạng khác nhau nên có thể nhận xét sơ bộ đây là các chủng vi sinh vật khác nhau.
Những vi sinh vật phân lập được là những chủng đặc trưng cho vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa nên sẽ tối thích ứng với việc bẻ ngắn mạch fucoidan được sản xuất tại Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang. Do trong tự nhiên chính những chủng vi sinh vật này là những vi sinh vật sống cộng sinh trên cây rong được dùng làm nguyên liệu để sản xuất fucoidan.
Từ một nguồn phân lập là rong biển, nước biển, bùn biển và nước chiết fucoidan để lâu ngày có thể phân lập từ 2-5 chủng vi sinh vật như vậy là có thể có nhiều chủng vi sinh vật cùng sống cộng sinh trên cùng một cây rong.
So với các kết quả đã được công bố trên thế giới thì số lượng các chủng vi sinh vật chúng tôi phân lập được từ một nguồn rong là ít hơn. Trong khi đó các nhà khoa học Hàn Quốc đã phân lập được 185 chủng từ các nguồn từ các nguồn rong biển, nước biển và bùn biển [25]. Sự khác biệt này có thể được giải thích là do chúng tôi sử dụng môi trường phân lập có tính chọn lọc để hạn chế các chủng vi sinh vật không mong muốn giúp cho quá trình sàng lọc diễn ra nhanh hơn. Trong khi đó các nhà khoa học Hàn Quốc sử dụng môi trường phân lập có chứa nguồn dinh dưỡng dồi dào (bactopepton, dịch chiết nấm men) nên họ phân lập được hầu như các vi sinh vật sống trong môi trường biển.
Bên cạnh chúng tôi còn phân lập được các chủng nấm mốc, là chủng thường có họat tính enzyme ngoại bào, vì thế đây có thể là nguồn cung cấp enzyme hữu hiệu cho sản xuất công nghiệp.
3.2. Sàng lọc vi sinh vật biển theo định hƣớng sinh enzyme cắt ngắn mạch fucoidan fucoidan
Sau khi phân lập được 24 chủng vi sinh vật biển theo định hướng sinh enzyme cắt ngắn mạch fucoidan, chúng tôi tiến hành sàng lọc một lần nữa để tìm ra chủng vi sinh vật thực sự có khả năng cắt mạch fucoidan trên từng mẫu fucoidan cụ thể chiết từ các loài rong khác nhau là: S. mcclurei, S. microcystum, S. polycystum
(các loại fucoidan này được sử dụng làm cơ chất để thử hoạt tính enzyme). Các chủng vi sinh vật được cấy chuyển sang môi trường lỏng M4 có bổ sung fucoidan sạch (được chiết từ rong S. mcclurei) như là chất cảm ứng vi sinh vật sản xuất enzyme cắt mạch fucoidan, nuôi cấy lắc (150 vòng/ phút, ở nhiệt độ 28-300C, trong 24h).
Hình 3.1: Lên men vi sinh vật để tạo enzym fucoidanase
Vì không biết các chủng vi sinh vật này sinh enzyme nội bào hay ngoại bào nên qua trình sàng lọc sử dụng cả nịch nuôi cấy cũng như dịch chiết từ sinh khối vi sinh như là nguồn enzyme. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.2: Hoạt tính enzyme khi lên mem vi sinh vật trên môi trƣờng lỏng
chứa fucoidan từ rong S. mcclurei.
Chủng vi sinh vật
Đơn vị hoạt tính(U) Dịch ngoại bào S. mcclurei Dịch nội bào S. mcclurei F1 - 0.328 F2 - - F3 - - F4 - 0.4 F5 - - F6 - - F7 - - F8 - - F9 - - F10 - - F11 - - F12 - 0.312 F13 - - F14 - 0.47 F15 - - F16 - - F17 - - F 18 - - F19 - - F20 - - F21 - - F22 - - F23 - - F24 - -
Khi nuôi cấy các chủng phân lập được trên môi trường lên men với fucoidan chiết từ rong S. mcclurei thì các chủng F1, F4, F12, F14 đều sinh enzyme nội bào có họat tính trên cơ chất fucoidan của rong S. mcclurei. Điều này hoàn toàn có thể giải (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thích được vì fucoidan chiết từ rong S. mcclurei cảm ứng sự tiết enzyme của các chủng F1, F4, F12, F14 nên dịch enzyme của chúng cũng có tác dụng lên cơ chất fucoidan S. mcclurei. Các enzyme này gọi là enzyme cảm ứng. còn các chủng khác không có họat tính vì cơ chấtfucoidan S. mcclurei không phải là chất cảm ứng thích hợp cho chúng, các chủng này có thể có hoạt tính trên fucoidan của rong khác với chất cảm ứng khác.
Như vậy mặc dù được phân lập từ các nguồn rong khác nhau nhưng với cùng