Chủng vi sinh vật đã phân lập được tiến hành nuôi cấy lắc (150 vòng/ phút, ở nhiệt độ 28-300C, trong 24h), trong môi trường muối khoáng có bổ sung fucoidan sạch (được chiết từ rong S. mcclurei) như là chất cảm ứng vi sinh vật sản xuất enzyme cắt mạch fucoidan.
Canh trường sau khi lên men được ly tâm 20 phút (tốc độ 10.000 vòng/phút) ở 40C. Phần dịch nổi thu lại để thử hoạt tính enzyme (dịch ngoại bào), phần sinh khối tế bào được hòa tan trong đệm acetate 0.01M, pH 5.2 (tỉ lệ V là 1:1). Dịch tế bào sau khi được phá vỡ bằng N2 lỏng trong thời gian 2 phút được nghiền bằng máy siêu âm trong 5 phút ở 00C. Sau đó dịch tế bào được ly tâm trong 20 phút (tốc độ 10.000 vòng/phút) ở 40C. Dịch trong ở trên có chứa enzyme được giữ lại, loại bỏ tủa chứa cặn tế bào rồi thử nghiệm hoạt tính enzyme (dịch nội bào).
Hình 2.3: Sơ đồ nuôi cấy và tách chiết enzyme từ vi sinh vật. 2.2.3Thử nghiệm họat tính enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan
Một hỗn hợp dung dịch gồm 50µl dịch chiết tế bào vi sinh vật được trộn đều với 250µl cơ chất fucoidan 0.5% (pha trong nước) ủ 5 giờ ở 370C. Hoạt tính enzyme cắt mạch fucoidan được đánh giá là sự tăng đường khử trong hỗn hợp phản ứng. Nồng độ của đường khử tạo thành được xác định theo phương pháp Nelson- Somogyi[36]. Phần sinh khối Thử nghiệm hoạt tính enzyme Phần dịch nổi L1 Ly tâm 10.000rpm/20’/40 C Lên men trên môi
trường M4 Phần dịch nổi Ex Phá vỡ màng tế bào bằng N2 lỏng Ly tâm 10.000 rpm/20’/40C Phá vỡ tế bào bằng
máy nghiền siêu âm Huyền phù với 1ml đệm acetate 0.01M pH5.2 Thử nghiệm hoạt tính enzyme
Xác định họat tính fucoidanase
Hoạt tính fucoidanase được xác định theo phương pháp Nelson trên cơ chất fucoidan được chiết từ rong S. mcclurei. Dưới tác dụng của enzyme fucoidanase, fucoidan bị cắt mạch tạo ra oligosaccharide và các đường khử. Vì vậy sự gia tăng lượng đường khử trong hỗn hợp phản ứng sau khi enzyme tác dụng là thước đo hoạt lực enzyme. Nhờ tính chất khử của nhóm (-CHO) của đường khi phản ứng với dung dịch đồng hóa trị 2 tạo thành kết tủa Cu2O. Tủa Cu2O tan trong thuốc thử arseno-molybden, tạo thành phức chất màu xanh da trời và phức này hấp thụ cực đại ở bước sóng 750 nm. Như vậy có thể xác định khả năng phân giải polysaccharide của fucoidanase thông qua hàm lượng Cu phản ứng.
Một đơn vị hoạt tính fucoidanase (U) được định nghĩa là số μM sản phẩm đường khử tạo thành trong 1 đơn vị thời gian (5 giờ ở 370C). Đơn vị hoạt tính enzyme được tính theo công thức sau:
U = X / 180
Trong đó, X: nồng độ fucose; U: đơn vị hoạt tính 1 μmol fucose = 180 μg/ml
Đường chuẩn fucose
y = 0.0105x + 0.0329 R2 = 0.995 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 20 40 60 80 100 120 [microgam/ml] O D 7 5 0 H Hììnnhh22..44::ĐĐưườờnnggcchhuuẩẩnnffuuccoossee..
2.2.4 Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng lên hoạt tính enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan
2.2.4.1 Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm đến việc thu nhận sinh khối tế bào
Canh trường sau khi lên men chủng F14 (nuôi lắc 24h, tốc độ lắc 150 vòng/phút, ở 28-300C) được ly tâm với 3.000 vòng/ phút ở 40C. Thu nhận sinh khối tế bào (3.000).
Phần dịch nổi tiếp tục được ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 20 phút ở 40
C, thu nhận phần cặn (10.000).
Tiến hành phá vỡ tế bào để thu dịch chiết enzyme như phần 2.2.2. Thử nghiệm hoạt tính enzyme của các dịch chiết này.
2.2.4.2 Ảnh hưởng của các loại đệm lên hoạt tính enzyme
Sử dụng đệm phosphate 0.01M, pH 7; đệm acetate 0.01M, pH5.2 và đệm phosphate-citrate pH 4.0 để thử nghiệm hoạt tính enzyme.
Hỗn hợp mẫu gồm: 50 µl enzyme +50 µl đệm + 150 µl cơ chất (pha trong đệm). CE: 50 µl enzyme + 200 µl đệm. CS: 100 µl đệm + 150 µl cơ chất ( pha trong đệm). Hỗn hợp phản ứng được ủ trong 5 giờ, ở 370C. Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Nelson-Somogyi [28].
2.2.4.3 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme
Hỗn hợp phản ứng gồm 50 µl dịch chiết enzyme được trộn đều với 250 µl cơ chất fucoidan 0.5%. pH tối ưu của enzyme được xác định bằng cách thử nghiệm hoạt tính ở 370C với đệm acetate 0.1M, pH từ 3.5-8.0.
2.2.4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên họat tính enzyme
Hỗn hợp phản ứng gồm 50 µl dịch chiết enzyme được trộn đều với 250 µl cơ chất fucoidan 0.5%. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme được xác định bằng sự gia tăng lượng đường khử sau khi ủ hỗn hợp enzyme ở nhiệt độ khác nhau (10-700C) trong 5 giờ.
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập các chủng vi sinh vật biển theo định hƣớng sinh enzyme cắt ngắn mạch fucoidan mạch fucoidan
Do sự đa dạng rộng lớn của điều kiện sống mà các vi sinh vật biển được coi là những nguồn các hợp chất có hoạt tính sinh học đầy tiềm năng và nhiều triển vọng, bao gồm các enzyme quý hiếm. Một số vi sinh vật biển có khả năng bẻ ngắn mạch polysaccharide không tan trong nước như kitin, agar cũng như các polysaccharide trong thành tế bào rong biển. Khi bị tổn hại trong quá trình bảo tố, rong nâu trở thành đối tượng tấn công của các vi sinh vật thủy sinh và các vi sinh vật này có hệ enzyme có khả năng bẻ ngắn mạch polysaccharide tồn tại trong thành tế bào rong về dạng mono và oligosaccharide. Các saccharide này được sử dụng không chỉ cho bản thân các vi sinh vật kí sinh ngoài, mà cho cả các vi sinh vật biển khác. Các glycosidase thường được sinh bởi các vi sinh vật cộng sinh, ví dụ như vi sinh vật thuộc chi Vibrio gắn với rong nâu Laminaria longicruris có khả năng thủy phân laminaran, trong khi đó vi sinh vật phân lập từ rong đỏ Polisophonia lanosa, Hupnea charoides và Gracilaria gracilis có khả năng thủy phân agar [50]. Như vậy, có thể cho rằng rong biển là một nguồn các chất dinh dưỡng cho các vi sinh vật ký sinh ngoài.
Dựa trên cơ sở tham khảo các tài liệu như đã trình bày trên, chúng tôi tiến hành phân lập vi sinh vật bẻ ngắn mạch fucoidan từ các nguồn rong nâu, nước biển và bùn biển nơi mà rong sinh sống. Sử dụng môi trường M1 với nguồn carbon duy nhất là fucoidan từ S. mcclurei để làm môi trường phân lập. Đây là môi trường phân lập có tính chọn lọc, vì vậy chủng vi sinh vật nào mọc được trên môi trường này thì có khả năng sinh enzym phân cắt fucoidan tạo nguồn dinh dưỡng cho bản thân vi sinh vật. Kết quả chúng tôi thu được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.1: Các chủng vi khuẩn biển đã phân lập đƣợc. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
STT Nguồn phân lập Kí hiệu
chủng Đặc điểm khuẩn lạc 1 Rong S. seratum (3 chủng) F1 Khuẩn lạc trắng, nhầy, bóng 2 F2 Khuẩn lạc trắng, tròn, có nhân 3 F3 Khuẩn lạc vàng, tròn, bóng 4 Rong S. mcclurei (3 chủng)
F4 Khuẩn lạc trắng sữa, nhầy, bóng
5 F5 Khuẩn lạc trắng, tròn, lồi
6 F14 Khuẩn lạc trắng sữa, trơn, bóng,
tròn, đường kính 1mm
7 Nước biển
(3 chủng)
F6 Khuẩn lạc trắng sữa, tròn, viền vàng 8 F7 Khuẩn lạc trắng sữa, dẹt 9 F8 Khuẩn lạc tròn, dẹt, vàng nhạt 10 Bùn biển (3 chủng) F9 Khuẩn lạc vàng, dẹt, viền trắng 11 F10 Khuẩn lạc trắng, bóng, lồi 12 F11 Khuẩn lạc trắng trong, tròn, đục 13 Rong S. microcystum (3 chủng) F12 Khuẩn lạc trắng, nhầy bóng
14 F13 Khuẩn lạc trắng sữa, trơn, bóng,
tròn, đường kính 2mm
15 Rong S. polycystum
(2 chủng)
F15 Khuẩn lạc tròn, lồi, vàng nhạt, có viền sang xung quanh
16 F16 Khuẩn lạc dẹt, bóng, trắng trong,
hình bầu dục 17 Nước chiết fucoidan để lâu
ngày (5 chủng) F17 Mốc đen 18 F18 Mốc vàng nâu 19 F19 Mốc xanh 20 F20 Mốc đen, viền trắng 21 F21 Mốc nâu
22 Rong Nâu tàn lụi không
xác định được loài (3 chủng)
F22 Mốc vàng
23 F23 Mốc vàng ở giữa, viền trắng
Chúng tôi đã phân lập được 24 chủng vi sinh vật biển bao gồm cả nấm mốc và vi khuẩn, mặc dù được phân lập trên môi trường giống nhau nhưng khuẩn lạc có hình dạng khác nhau nên có thể nhận xét sơ bộ đây là các chủng vi sinh vật khác nhau.
Những vi sinh vật phân lập được là những chủng đặc trưng cho vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa nên sẽ tối thích ứng với việc bẻ ngắn mạch fucoidan được sản xuất tại Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang. Do trong tự nhiên chính những chủng vi sinh vật này là những vi sinh vật sống cộng sinh trên cây rong được dùng làm nguyên liệu để sản xuất fucoidan.
Từ một nguồn phân lập là rong biển, nước biển, bùn biển và nước chiết fucoidan để lâu ngày có thể phân lập từ 2-5 chủng vi sinh vật như vậy là có thể có nhiều chủng vi sinh vật cùng sống cộng sinh trên cùng một cây rong.
So với các kết quả đã được công bố trên thế giới thì số lượng các chủng vi sinh vật chúng tôi phân lập được từ một nguồn rong là ít hơn. Trong khi đó các nhà khoa học Hàn Quốc đã phân lập được 185 chủng từ các nguồn từ các nguồn rong biển, nước biển và bùn biển [25]. Sự khác biệt này có thể được giải thích là do chúng tôi sử dụng môi trường phân lập có tính chọn lọc để hạn chế các chủng vi sinh vật không mong muốn giúp cho quá trình sàng lọc diễn ra nhanh hơn. Trong khi đó các nhà khoa học Hàn Quốc sử dụng môi trường phân lập có chứa nguồn dinh dưỡng dồi dào (bactopepton, dịch chiết nấm men) nên họ phân lập được hầu như các vi sinh vật sống trong môi trường biển.
Bên cạnh chúng tôi còn phân lập được các chủng nấm mốc, là chủng thường có họat tính enzyme ngoại bào, vì thế đây có thể là nguồn cung cấp enzyme hữu hiệu cho sản xuất công nghiệp.
3.2. Sàng lọc vi sinh vật biển theo định hƣớng sinh enzyme cắt ngắn mạch fucoidan fucoidan
Sau khi phân lập được 24 chủng vi sinh vật biển theo định hướng sinh enzyme cắt ngắn mạch fucoidan, chúng tôi tiến hành sàng lọc một lần nữa để tìm ra chủng vi sinh vật thực sự có khả năng cắt mạch fucoidan trên từng mẫu fucoidan cụ thể chiết từ các loài rong khác nhau là: S. mcclurei, S. microcystum, S. polycystum
(các loại fucoidan này được sử dụng làm cơ chất để thử hoạt tính enzyme). Các chủng vi sinh vật được cấy chuyển sang môi trường lỏng M4 có bổ sung fucoidan sạch (được chiết từ rong S. mcclurei) như là chất cảm ứng vi sinh vật sản xuất enzyme cắt mạch fucoidan, nuôi cấy lắc (150 vòng/ phút, ở nhiệt độ 28-300C, trong 24h).
Hình 3.1: Lên men vi sinh vật để tạo enzym fucoidanase (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Vì không biết các chủng vi sinh vật này sinh enzyme nội bào hay ngoại bào nên qua trình sàng lọc sử dụng cả nịch nuôi cấy cũng như dịch chiết từ sinh khối vi sinh như là nguồn enzyme. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.2: Hoạt tính enzyme khi lên mem vi sinh vật trên môi trƣờng lỏng
chứa fucoidan từ rong S. mcclurei.
Chủng vi sinh vật
Đơn vị hoạt tính(U) Dịch ngoại bào S. mcclurei Dịch nội bào S. mcclurei F1 - 0.328 F2 - - F3 - - F4 - 0.4 F5 - - F6 - - F7 - - F8 - - F9 - - F10 - - F11 - - F12 - 0.312 F13 - - F14 - 0.47 F15 - - F16 - - F17 - - F 18 - - F19 - - F20 - - F21 - - F22 - - F23 - - F24 - -
Khi nuôi cấy các chủng phân lập được trên môi trường lên men với fucoidan chiết từ rong S. mcclurei thì các chủng F1, F4, F12, F14 đều sinh enzyme nội bào có họat tính trên cơ chất fucoidan của rong S. mcclurei. Điều này hoàn toàn có thể giải
thích được vì fucoidan chiết từ rong S. mcclurei cảm ứng sự tiết enzyme của các chủng F1, F4, F12, F14 nên dịch enzyme của chúng cũng có tác dụng lên cơ chất fucoidan S. mcclurei. Các enzyme này gọi là enzyme cảm ứng. còn các chủng khác không có họat tính vì cơ chấtfucoidan S. mcclurei không phải là chất cảm ứng thích hợp cho chúng, các chủng này có thể có hoạt tính trên fucoidan của rong khác với chất cảm ứng khác.
Như vậy mặc dù được phân lập từ các nguồn rong khác nhau nhưng với cùng cơ chất cảm ứng sẽ kích thích vi sinh vật sinh ra các loại enzyme có tác dụng lên chính cơ chất đã cảm ứng.
Chủng F14 và F4 được phân lập từ nguồn rong S. mcclurei, nuôi cảm ứng trên môi trường sàng lọc cũng chứa fucoidan chiết từ rong S. mcclurei, dịch chiết enzyme cũng có hoạt tính trên cơ chất fucoidan chiết từ rong S. mcclurei, như vậy mỗi chủng F4 và F14 này chỉ có thể sinh ra một loại enzyme cắt mạch fucoidan đối với một cơ chất nhất định. Theo số liệu (bảng 3.2) thì enzyme sinh ra từ chủng F4 có thể cùng một loại enzyme với chủng F14, điều này là do chúng được phân lập và sàng lọc trên cùng một loại fucoidan.
Cả hai chủng F14 và F4 đều cho hoạt tính cao hơn so với hai chủng F2 và F12, có thể là do enzyme từ 2 chủng này có tính đặc hiệu cao. Vì chúng được phân lập và sàng lọc trên cùng một loại rong, nên fucoidan được chiết từ loại rong này sẽ rất thích hợp cho hệ enzyme được phân lập từ chủng vi sinh vật sống trên cây rong này.
Như vậy mặc dù phân lập được 24 chủng vi sinh vật biển từ bùn biển, nước biển và rong biển nhưng chỉ có 4 chủng ngồn gốc từ rong biển là có khả năng sinh enzyme cắt mạch fucoidan chiết từ rong S. mcclurei ( bảng 3.2).
Ta có thể đưa ra kết luận là khi sử dụng các chất cảm ứng khác nhau thì vi sinh vật sẽ tạo ra những loại enzyme khác nhau, lợi dụng tính chất này ta có thể điều khiển được quá trình sản xuất enzyme.
Theo kết quả (bảng 3.2) thì chủng F14 cho hoạt tính enzyme là cao nhất, vì vậy chúng tôi chọn chủng này để tiếp tục sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.3. Khảo sát điều kiện tách chiết enzyme
Chủng F14 lên men và tiến hành tách chiết enzyme, đồng thời khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme này.
3.3.1. Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm đến việc thu nhận sinh khối tế bào
Sau khi lên men chủng F14 trên môi trường M4, tiến hành ly tâm 3000 vòng/ phút ở 40C trong 20 phút để thu sinh khối tế bào.
Phần dịch nổi tiếp tục ly tâm 10.000 vòng/ phút 40C trong 20 phút để thu phần cặn.
Phá vỡ tế bào như ở phần 2.2.2. Sau đó thử hoạt tính enzyme theo phương pháp Nelson-Somogyi [28]. Kết quả được thể hiện ở bảng dưới đây.
Bảng 3.3: Hoạt tính enzyme khi ly tâm với tốc độ khác nhau.
Tốc độ ly tâm (rpm)
Đơn vị hoạt tính(U) Fucoidan từ S. mcclurei Fucoidan từ S. evanescens 3.000 0.421 0.683 10.000 0 0.189
Theo kết quả thu được ở bảng trên ta thấy: ở tốc độ ly tâm 3.000rpm thì cả hai cơ chất là fucoidan từ S.mcclurei và fucoidan từ S.evanescens đều có hoạt tính enzyme cao hơn so với tốc độ ly tâm 10.000rpm. Điều này có thể được giải thích là do khi ly tâm với tốc độ 3.000rpm chỉ có phần sinh khối tế bào lắng xuống đáy, phần dịch bên trên chứa đường, polysaccharide và các thành phần khác. Nên khi ly tâm 10.000rpm thì phần cặn thu được không còn sinh khối tế bào nên không có hoạt tính enzyme.
Như vậy ly tâm với tốc độ 3.000rpm là tốt nhất cho việc thu nhận sinh khối tế bào.
3.3.2. Ảnh hưởng của các loại đệm lên hoạtt tính enzyme
Thử nghiệm hoạt tính enzyme cắt ngắn mạch fucoidan của chủng F14 khi sử dụng 3 loại đệm khác nhau: đệm phosphate 0.01M, pH 7.2; đệm acetate 0.01M, pH 5.2 và đệm phosphate – citrate pH 4.0. Kết quả thu được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của các loại đệm lên hoạt tính enzyme.
Đệm Cơ chất Hoạt tính enzyme
(U: µg/5h) phosphate 0.01M, pH 7.2 Fucoidan từ S. mcclurei 0 Fucoidan từ Fucus evannescens 0.189 acetate 0.01M, pH 5.2 Fucoidan từ S. mcclurei 0.524 Fucoidan từ Fucus evannescens 0.633 phosphate – citrate
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});