CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.4. Một số ứng dụng của chỉ thị phân tử
Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau; sự đa dạng về gen có thể di truyền được trong một quần thể hoặc giữa các quần thể. Nghiên cứu đa dạng di truyền còn giúp đánh giá nguồn tài nguyên di truyền của tập đoàn giống cây trồng, vật nuôi, giúp cho việc sử dụng nguồn tài nguyên di truyền hiệu quả hơn. Đặc biệt, nghiên cứu đa dạng di truyền có thể giúp tiên đoán khả năng cho ưu thế lai giữa các cặp bố mẹ (cặp bố mẹ nào có khoảng cách di truyền xa hơn thường sẽ cho ưu thế lai lớn hơn).
Một số chương trình phân tích đa dạng di truyền
NTSYS: Rất phổ biến. Sử dụng các thông số “1” hay “+” (có mặt), và “0”
hay “-“ (vắng mặt). Có thể dùng chương trình NTSYS cho các chỉ thị phân tử RAPD, AFLP hay các chỉ thị “trội’ khác.
PopGene: Tương đối phổ biến. Sử dụng các thông số “1” (có mặt) và “0”
(vắng mặt) trong trường hợp chỉ thị di truyền là “trội”, hoặc các thông số AA, BB, CC, AB, AC, BC... trong trường hợp chỉ thị di truyền là “đồng trội”. Ngoài ra, PopGene còn được sử dụng trong trường hợp cần đánh giá những mẫu vật của nhiều quần thể hoặc nhóm các quần thể.
1.4.2. Nghiên cứu lập bản đồ di truyền
Bản đồ di truyền phân tử được thiết lập dựa trên cơ sở các loại chỉ thị phân tử ADN (các chỉ thị RFLP, STS, SSR, RAPD, AFLP...). Trong quá trình giảm phân, các gen trên cùng NST thường được phân ly cùng nhau như một nhóm liên kết gen.
Tuy nhiên, sự liên kết này không hoàn toàn do kết quả của quá trình trao đổi chéo giữa các NST tương đồng. Kết quả của hiện tượng này là sự tái tổ hợp giữa các gen trong một cặp NST hay giữa các nhiễm sắc thể. Tần số trao đổi chéo giữa hai gen nào đó phản ánh khoảng cách di truyền giữa chúng và cho phép lập bản đồ di truyền của NST biểu thị vị trí tương đối của các gen [7]. Sự liên kết của những gen nằm trên cùng một NST được trình bày thành một bản đồ liên kết hay bản đồ NST thể hiện trình tự tuyến tính của các gen dọc theo NST với khoảng cách giữa các gen liền kề tỉ lệ thuận với tần số tái tổ hợp giữa chúng. Đơn vị khoảng cách trong bản đồ liên kết được coi là đơn vị bản đồ, nó được xác định bằng phần trăm (%) tần số tái tổ
hợp, trong đó 1 centiMorgan (cM) tương đương với 1% tái tổ hợp. Bản đồ di truyền phân tử được lập trên cơ sở sự liên kết giữa các chỉ thị phân tử với các gen kiểm soát các tính trạng nghiên cứu. Sự có mặt của gen quan tâm trong các cá thể nghiên cứu thể hiện ở kiểu hình. Các chỉ thị ADN đồng phân ly với các gen là những chỉ thị liên kết gen. Khoảng cách di truyền giữa các chỉ thị và gen được thể hiện bằng tần số tái tổ hợp giữa chúng.
1.4.3. Trong chọn giống cây trồng
Từ lâu, các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị hình thái liên kết với một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng chúng như một phương tiện hữu ích trong quy trình chọn tạo giống mới. Ở đây, thay vì phải đánh giá kiểu hình của cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong muốn, người ta chỉ cần đi tìm những cá thể riêng biệt mang các chỉ thị hình thái liên kết với các gen đó.
Tuy nhiên các chỉ thị hình thái vốn có số lượng không nhiều, còn những chỉ thị
“may mắn” (liên kết với gen quan tâm) lại càng hiếm gặp, vì thế giá trị thực tiễn của chỉ thị hình thái trong chọn giống gặp nhiều hạn chế. Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chỉ thị phân tử, các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm mạnh mẽ hơn tới vấn đề “chọn giống nhờ chỉ thị phân tử” (Marker-assisted selection - MAS) với mục đích sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết với các gen mong muốn trong chọn tạo giống mới. So với chỉ thị hình thái, chỉ thị phân tử có những ưu thế sau:
Kiểu gen của các Locut chỉ thị phân tử có thể được xác định tại bất kỳ giai đoạn nào và ở bất cứ mức độ nào: tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể, trong khi kiểu hình của phần lớn các chỉ thị hình thái chỉ có thể phân biệt được trong những giai đoạn nhất định và thường ở mức độ toàn bộ cơ thể.
Số lượng các chỉ thị phân tử là cực kỳ lớn, trong khi số lượng các chỉ thị hình thái rất hạn chế.
Các alen khác nhau của chỉ thị phân tử thường không liên kết với các hiệu ứng có hại, trong khi việc đánh giá các chỉ thị hình thái thường hay đi kèm với những hiệu ứng kiểu hình không mong muốn.
Các alen của các chỉ thị phân tử phần lớn là đồng trội, vì thế cho phép phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào, còn các alen của các chỉ thị hình thái thường tương tác theo kiểu trội - lặn, do đó bị hạn chế sử dụng trong nhiều tổ hợp lai.
Đối với chỉ thị hình thái, các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc đánh giá các cá thể phân ly ở trong cùng một quần thể phân ly, còn đối với chỉ thị phân tử, hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất hiếm gặp.
Bert Collard & David Mackill đưa ra khái niệm chọn lọc giống lúa dựa trên chỉ thị phân tử (Marker assisted selection - MAS) là sử dụng chỉ thị ADN liên kết chặt với Locut mục tiêu để thay cho chọn lọc đánh giá kiểu hình với giả định chỉ thị ADN (ADN markers) có thể dự đoán kiểu hình một cách đáng tin cậy [14].
MAS ứng dụng trong chọn tạo giống lúa có những ưu điểm nổi bật là: đặc biệt với những tính trạng khó đánh giá thanh lọc dựa trên kiểu hình; tiết kiệm thời gian và nguồn lực trong quá trình chọn lọc; rất quan trọng với một số tính trạng như chất lượng hạt; có thể chọn lọc sớm, trước khi gieo trồng, có thể chọn ngay ở thế hệ phân ly F2 hoặc F3; không bị ảnh hưởng của môi trường; có thể phân biệt giữa đồng hợp và dị hợp và chọn lọc từng cây. Trong một số trường hợp thuận lợi, đôi khi các nhà chọn giống chỉ cần lai trở lại 3 thế hệ là có thể đạt được mục tiêu của mình [6].
Theo E. Francia, 2005, sự thành công của hệ thống chọn giống nhờ MAS phụ thuộc vào các yếu tố: bản đồ di truyền với một số lượng hợp lý các chỉ thị đa hình tại các vùng tương đồng để định vị chính xác QTLs hay gen quan tâm; mối liên kết chặt giữa chỉ thị và các gen kháng hay các QTLs; sự tái tổ hợp thích hợp giữa các chỉ thị và phần còn lại của bộ gen; khả năng đánh giá một số lượng lớn cá thể trong một thời gian và giá thành hiệu quả.
Có 2 kiểu chỉ thị có thể ứng dụng trong MAS. Một là chỉ thị phân tử được định vị ngay trong phạm vi gen quan tâm. Đây là trường hợp lý tưởng nhất cho MAS, nhưng rất khó tìm thấy loại chỉ thị này. Hai là nhóm chỉ thị có khuynh hướng di truyền cùng với gen quan tâm. Mối quan hệ này tìm thấy khi gen và chỉ thị có khoảng cách vật lý gần nhau. Chọn lọc dựa trên chỉ thị này gọi là LD-MAS (Linkage Disequilibrium -MAS).
Như vậy, chỉ thị phân tử làm tăng thêm hiệu quả sàng lọc trong các chương trình chọn giống với nhiều ưu điểm:
Khả năng chọn lọc ngay từ giai đoạn cây con đang nẩy mầm trong khi nhiều dấu hiệu chỉ có thể sàng lọc khi chúng được biểu hiện ở những giai đoạn muộn hơn trong
quá trình sống nếu chỉ sử dụng phương pháp chọn giống cổ điển (ví dụ: chất lượng quả và hạt, tính bất dục đực, khả năng phản ứng chu kỳ quang).
Khả năng sàng lọc những dấu hiệu mà việc đánh giá các đặc tính này khó khăn, đắt tiền, tốn thời gian (ví dụ như hình thái rễ, tính kháng nhiễm đối với các dịch hại hoặc đối với những nòi, những bệnh đặc hiệu, hay tính kháng những điều kiện gây sốc sinh học như hạn, mặn, thiếu muối, các chất độc).
Khả năng chọn lọc đồng thời vài đặc tính trong cùng một thời gian, do vậy có thể đưa vào cùng lúc vài gen có giá trị về mặt nông học, ví dụ đưa vào cùng một lúc nhiều gen kháng dịch hại khác nhau. Trong trường hợp này, các phương pháp sàng lọc kiểu hình các cá thể thông qua sự lây nhiễm (đồng thời hoặc thậm chí lần lượt từng thể gây bệnh hay từng côn trùng gây hại) rất khó đạt được kết quả. Nhưng nếu áp dụng công nghệ chỉ thị phân tử có thể kiểm tra sự có mặt hay vắng mặt của từng alen kháng (hay nhiễm) khác nhau ở từng cá thể riêng biệt.
1.4.4. Chọn giống bằng chỉ thị phân tử và lai trở lại (Marker Assited Backcrossing - MABC)
Trong quy trình chọn tạo giống truyền thống, người ta đưa nguồn gen mới có tính trạng mong muốn vào 1 giống khác bằng phương pháp lai trở lại liên tục qua 5- 6 thế hệ, hoặc chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly từ thế hệ F2 đến các thế hệ tiếp theo. Bằng phương pháp này việc đưa gen lặn vào tổ hợp lai hoặc du nhập cùng một lúc vài gen mong muốn vào một dòng ưu việt thường gặp rất nhiều khó khăn hoặc đôi khi không thể thực hiện được [31].
Trong trường hợp có một giống cây trồng ưu tú nhưng cần đưa thêm một vài gen mong muốn vào giống đó, người ta sử dụng quy trình lai trở lại (trở lại) nhiều lần với giống ưu tú nhằm thu được một giống cây trồng mới mang gen mong muốn nhưng vẫn giữ nguyên nền di truyền của giống ưu tú. Theo quy trình chọn giống lai trở lại truyền thống, phải ít nhất 6-8 thế hệ trở lại mới thu được cây mang gen mong muốn nhưng giữ được gần 100% nền gen di truyền của giống ưu tú (bảng 3).
Bảng 3. Sự tương quan giữa số thể hệ BCnF1 với tỷ lệ kiểu gen của dòng ưu tú (nhận gen mong muốn) được đưa vào con lai BCnF1
Số thế hệ
backcross (n) Tỷ lệ % kiểu gen của dòng nhận gen
1 75
2 87,5
3 93,8
4 96,9
5 98,4
6 99,2
Gần đây, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chọn giống nhờ chỉ thị phân tử, các nhà khoa học đã đưa ra một phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử mới – đó là “Chọn giống trên cơ sở chỉ thị phân tử và lai trở lại (Marker Assisted BackCrossing – MABC).
MABC là phương pháp thiết thực, hiệu quả trong việc đưa Locut gen quy định tính trạng di truyền số lượng (QTL) hay gen mong muốn vào giống ưu tú nhằm chọn tạo giống mới mang gen/QTL mong muốn nhưng vẫn giữ nguyên (gần 100%) nền gen di truyền của giống ưu tú với thời gian chọn giống rất ngắn: quy trình chọn giống kết thúc ở thế hệ BC3, thậm chí BC2.
Nguyên lý của phương pháp MABC là chuyển một QTL/gen từ dòng cho gen vào dòng nhận gen trong khi chọn lọc nền di truyền của dòng cho thông qua phân tích toàn bộ hệ gen bằng chỉ thị phân tử. (Thomson và ctv., 2010)[40]. Việc sử dụng các chỉ thị phân tử cho phép khảo sát di truyền của con lai ở mỗi thế hệ, đẩy nhanh tốc độ của quá trình chọn lọc, vì thế tăng cường nền di truyền qua mỗi thế hệ.
Ưu điểm chính của phương pháp MABC là:
(1) Chọn lọc bằng chỉ thị phân tử đối với Locut gen đích (2) Chọn lọc nền di truyền đối với hệ gen cây bố mẹ tái tổ hợp (3) Tiến gần đến Locut quan tâm trên bản đồ liên kết
(4) Chọn giống ngẫu nhiên kiểu gen mới với một số tính trạng quan tâm.
Hiệu quả của các sản phẩm MABC sẽ được thể hiện trên đồng ruộng [38]. Ngoài ra,
đôi, thậm chí gấp ba (chỉ cần đến thế hệ BC2 hoặc BC3 là đạt kết quả tương đương với BC6 theo phương pháp thông thường.
Chọn giống trở lại nhờ chỉ thị phân tử còn giúp khắc phục được những trở ngại mà công tác chọn giống truyền thống rất khó giải quyết nhờ loại bỏ được các tác động gây nhiễu do các tương tác trong cùng một alen hay giữa các alen gây ra.
Những tương tác này thường không thể phát hiện được bằng cách phân tích kiểu hình. Phương pháp này còn đặc biệt hiệu quả trong trường hợp cần đưa nhiều gen khác nhau vào một nền gen ưu việt.