3.3.2. Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC2F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996) AS996)
Hai cá thể P284 và P307 của thế hệ BC1F1 mang tỉ lệ nền gen cây nhận tương ứng là 89.06% và 86.36%. Hai cây này đã được sử dụng để phát triển quần thể thế hệ BC2F1.
500 cá thể của quần thể BC2F1 thuộc phép lai (AS996/FL478/AS996/ AS996) đã được trồng và phân tích ADN. Tương tự như các bước phân tích trên các cá thể thuộc thế hệ BC1F1, các bước phân tích sự có mặt của gen đích, phân tích xác định cây tái tổ hợp rồi phân tích tồn bộ nền gen sử dụng các chỉ thị nằm trên 12 nhiễm sắc thể đã được tiến hành. Bước phân tích gen đích sử dụng chỉ thị AP3206, RM3412, RM10793, RM10711 (Hình 3.11; 3.12). Các cá thể có mang hai băng đối với cả bốn chỉ thị này sẽ được chọn lựa cho bước phân tích tái tổ hợp sử dụng các chỉ thị RM10694, RM562, RM7075 nằm về hai phía của vùng Saltol trên nhiễm sắc thể số 1. Trong tổng số 250 cây dị hợp tử đã xác định được 26 cây tái tổ hợp trên vùng gen Saltol.
Hình 14. Sàng lọc cá thể BC2F1(AS996/FL478/AS996/ AS996) sử dụng chỉ
thị RM3412. Làn gel từ 1 đến 57: các cá thể BC2F1; 58: FL478, 59: AS996
Hình 15. Sàng lọc cá thể BC2F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996) sử dụng chỉ thị
RM10793 (bên trái), và RM10711 (bên phải).
1 10 20 30 40 50 59 FL AS
Bước phân tích xác định cây mang nhiều nền gen cây nhận đã được tiến hành với tổng số 48 chỉ thị SSR nằm rải rác trên 12 nhiễm sắc thể. Kết quả cho thấy các cây P307-322, P284-112 and P307-305 là những cây tốt nhất, mang từ 93.18% đến 94.03% nền gen cây nhận AS996. Ba cây này đã được sử dụng trong phép lai trở lại để tạo thế hệ BC3F1 tiếp theo. Mỗi cây sử dụng một nửa số bông cho lai trở lại và một nửa tự thụ tạo thế hệ BC2F2. Trong trường hợp sử dụng chọn giống truyền thống, tỉ lệ nền gen cây nhận đạt cao nhất là 87.5% trong thế hệ BC2F1, nhưng ở nghiên cứu này, tỉ lệ nền gen cây nhận thu được cao hơn từ 5.7- 6.5% so với chọn giống truyền thống.
3.3.3. Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC3F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996/AS996 )
Từ kết quả phân tích cá thể thế hệ BC2F1, 3 cá thể mang tỉ lệ nền gen nhận cao nhất đã được lai trở lại tạo lập quần thể BC3F1 của tổ hợp AS996 mang Saltol.
Hình 16. Sàng lọc các thể BC3F1 (AS996/FL478/AS996/AS996/AS996)
sử dụng chỉ thị RM3412 (A), RM10711 (B), RM10793 (C), AP3206 (D) và RM10694 (E). Làn gel 1: AS996, Làn gel 2: FL478.
Tổng số 371 cá thể đã được phân tích với các chỉ thị định vị trên vùng gel
Saltol. Phát hiện 94 cá thể mang gen đích được phân tích tái tổ hợp. Sàng lọc các
A
B
C
D
thể BC3F1(AS996/FL478/AS996/AS996/AS996) sử dụng chỉ thị RM3412, RM10711, RM10793, AP3206, và RM10694 trên hình 3.13. Phân tích ADN các cá thể tái tổ hợp mang gen đích với 63 chỉ thị phân tử SSR. Số liệu về kiểu gen của 14 cá thể được đưa vào phân tích bằng phần mền GGT2.0, đã xác định cá thể P284- 112-291 của quần thể BC3F1 là tốt nhất trong 5 cá thể tái tổ hợp P284-112-291, P307-305- 21, P284-112-195, P284-112-198, P284-112-213 mang nhiều nền di truyền cây nhận gen, cả 5 cây này đã được chọn cho quá trình chọn giống SALTOL- AS996 ở các thế hệ sau.
Sơ đồ nền gen của cá thể P284-112-291 thể hiện trên hình 3.14.: Tại các locut nằm ở vị trí của gen Saltol, cây P284-112-291 có băng màu xanh nhạt, thể hiện là mang locut dị hợp tử. Đối với các locut cịn lại trên các NST, cây P284-112- 291 đều có các locut màu đỏ, thể hiện băng của locut cây nhận gen hay là nền gen của giống AS996. Như vậy, với 63 chỉ thị rải rác trên 12 nhiễm sắc thể của lúa, đã xác định được cây mang gen đích và mang tới 100% nền gen cây nhận gen. Ngồi
Hình 17 Bản đồ của cây BC3F1 - P284-112-291 phân tích bằng phần
ra các dịng mang nền gen của giống nhận gen cao như P307-305- 21, P284-112- 195, P284-112-198, P284-112-213 cũng được giữ lại để chọn dòng và phát triển trong chọn giống. Những dòng này đã được thu hạt, đánh giá tính chống chịu mặn và một số chỉ tiêu nông sinh học và các yếu tố cấu thành năng suất để chọn ra những dòng triển vọng năng suất cao và có tính chịu mặn tốt.
3.3.4. Kết quả đánh giá tính chịu mặn các dịng chọn lọc
Thí nghiệm đánh giá tính chịu mặn ở thế hệ BC3F2, BC3F3 đã được tiến hành tại Viện Di truyền Nông nghiệp theo như đã mô tả ở phần “2.3.4. Phương pháp đánh giá mặn nhân tạo”. Các dòng được đánh giá mặn tại nồng độ muối bằng EC=12dSm, tương đương mức nhiễm mặn NaCl = 60/00. Các dòng BC3F2 tham gia thí nghiệm đều có mức độ kháng tương đương giống FL478 mang vùng gen Saltol. Các dòng này được đưa ra ruộng gieo trồng để theo dõi đánh giá và thu hạt cho lần thí nghiệm tiếp theo.
Ở thế hệ BC3F3, các dòng chọn lọc được đưa vào đánh giá tính chịu mặn.