Hình 10 cho thấy kết quả sàng lọc với chỉ thị RM10793, hầu hết các cá thể BC1F1trên gel là dị hợp tử với locut RM10793. Các cá thể mang băng dị hợp tử sẽ được ghi nhận lại để phân tích.
Sau đó phân tích xác định cây tái tổ hợp sử dụng các chỉ thị RM10694, RM562, RM7075 nằm về 2 phía của gen đích trên nhiễm sắc thể số 1.
Sau khi xác định các cá thể tái tổ hợp có chứa gen đích, tiếp tục bước phân tích các cây đã chọn ra bằng các chỉ thị nằm rải rác trên 12 nhiễm sắc thể của lúa đã được sử dụng để phân tích xác định cây mang nhiều nền gen cây nhận.
Hình 11, 12 cho thấy kết quả sàng lọc các cá thể BC1F1 với chỉ thị RM310, RM5639 cho phép lựa chọn các cá thể trên gel mang băng của cây nhận gel AS996 để chọn lựa tối đa nền gen cây nhận gen. Số liệu ghi nhận được phân tích trên trong Excel. Hai cây mang nhiều nền gen cây nhận gồm cá thể P284 và P307 mang tỉ lệ nền gen cây nhận tương ứng là 89.06% và 86.36% (bảng 3.1). Trong trường hợp chỉ sử dụng các phương pháp chọn giống truyền thống, tỉ lệ nền gen của cây nhận gen trong thế hệ này chỉ đạt được 75%, thấp hơn trong nghiên cứu này từ 16-19%.
Hình 12. Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM5639. Làn gel 1, 26: 25bp ladder, 2-25 và 27-48: Các cá thể BC1F1, 49:AS996, 50:FL478 1, 26: 25bp ladder, 2-25 và 27-48: Các cá thể BC1F1, 49:AS996, 50:FL478 1 2 25 A FL Hình 11. Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng chỉ thị RM310. Làn gel 1, 25, 51: 25bp ladder, 2-25 và 26-48: cá thể BC1F1, 49:AS996, 50: FL478 1 25 51
Bảng 8. Tỉ lệ nền gen cây nhận ở 12 cây tái tổ hợp ở thế hệ BC1F1 Cây số 5 49 28 38 81 84 05 07 11 01 11 26 A 55.26 51.43 60.53 44.74 56.25 78.13 66.67 75.76 63.64 73.68 66.67 63.64 H 34.38 37.93 36.36 34.38 15.63 21.88 33.33 21.21 36.36 80.00 33.33 36.36 R 72.45 70.39 78.71 61.92 64.06 89.06 83.33 86.36 81.82 73.68 83.33 81.82
Số liệu kiểu gen của các cá thể có chứa tái tổ hợp tại vị trí gen Saltol được
phân tích trên phần mềm GGT2.0. Kết quả thể hiện trên hình 3.10. Hình vẽ thể hiện bản đồ vị trí các chỉ thị SSR được sử dụng để sàng lọc NST số 1, 3, 4 và 10, các kí hiệu A: là kiểu gen cây mẹ, B: là kiểu gen cây bố; H: là dị hợp tử và K: là số liệu nghi ngờ. Nhìn vào hình vẽ có thể thấy rõ các locut phân tích với các kiểu gen đặc trưng cho giống cho hoặc nhận gen kháng.
0 cM RM171 2.6 RM 25022 3.6 R10M10 4.9 R10M17 8.6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 L e g e n d . A B H K Group 10 [chrom10] 0 cM RM518 2.0 R4M13 7.9 R4M17 11.5 R4M30 17.9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 L e g e n d . A B H K Group 4 [chrom4] 0 25 cM RM5639 8.1 SO3065 12.8 SO3068 14.8 SO3072 15.4 RM5626 24.7 RM6329 28.7 RM3867 31.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 L e g e n d . A B H K Group 3 [chrom3] 0 cM G11A 0.0 RM10694 1.0 AP3206e 2.0 RM10711A 3.0 RM3412A 4.0 RM493 5.0 RM10793 6.0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 L e g e n d . A B H K Group 1 [chrom1]
Hình 13: Bản đồ của một số cây BC1F1 (AS996/FL478/AS996) trên NST1, 3, 4 và
3.3.2. Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC2F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996) AS996)
Hai cá thể P284 và P307 của thế hệ BC1F1 mang tỉ lệ nền gen cây nhận tương ứng là 89.06% và 86.36%. Hai cây này đã được sử dụng để phát triển quần thể thế hệ BC2F1.
500 cá thể của quần thể BC2F1 thuộc phép lai (AS996/FL478/AS996/ AS996) đã được trồng và phân tích ADN. Tương tự như các bước phân tích trên các cá thể thuộc thế hệ BC1F1, các bước phân tích sự có mặt của gen đích, phân tích xác định cây tái tổ hợp rồi phân tích tồn bộ nền gen sử dụng các chỉ thị nằm trên 12 nhiễm sắc thể đã được tiến hành. Bước phân tích gen đích sử dụng chỉ thị AP3206, RM3412, RM10793, RM10711 (Hình 3.11; 3.12). Các cá thể có mang hai băng đối với cả bốn chỉ thị này sẽ được chọn lựa cho bước phân tích tái tổ hợp sử dụng các chỉ thị RM10694, RM562, RM7075 nằm về hai phía của vùng Saltol trên nhiễm sắc thể số 1. Trong tổng số 250 cây dị hợp tử đã xác định được 26 cây tái tổ hợp trên vùng gen Saltol.
Hình 14. Sàng lọc cá thể BC2F1(AS996/FL478/AS996/ AS996) sử dụng chỉ
thị RM3412. Làn gel từ 1 đến 57: các cá thể BC2F1; 58: FL478, 59: AS996
Hình 15. Sàng lọc cá thể BC2F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996) sử dụng chỉ thị
RM10793 (bên trái), và RM10711 (bên phải).
1 10 20 30 40 50 59 FL AS
Bước phân tích xác định cây mang nhiều nền gen cây nhận đã được tiến hành với tổng số 48 chỉ thị SSR nằm rải rác trên 12 nhiễm sắc thể. Kết quả cho thấy các cây P307-322, P284-112 and P307-305 là những cây tốt nhất, mang từ 93.18% đến 94.03% nền gen cây nhận AS996. Ba cây này đã được sử dụng trong phép lai trở lại để tạo thế hệ BC3F1 tiếp theo. Mỗi cây sử dụng một nửa số bông cho lai trở lại và một nửa tự thụ tạo thế hệ BC2F2. Trong trường hợp sử dụng chọn giống truyền thống, tỉ lệ nền gen cây nhận đạt cao nhất là 87.5% trong thế hệ BC2F1, nhưng ở nghiên cứu này, tỉ lệ nền gen cây nhận thu được cao hơn từ 5.7- 6.5% so với chọn giống truyền thống.
3.3.3. Phân tích kiểu gen các cá thể thuộc thế hệ BC3F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996/AS996 )
Từ kết quả phân tích cá thể thế hệ BC2F1, 3 cá thể mang tỉ lệ nền gen nhận cao nhất đã được lai trở lại tạo lập quần thể BC3F1 của tổ hợp AS996 mang Saltol.
Hình 16. Sàng lọc các thể BC3F1 (AS996/FL478/AS996/AS996/AS996)
sử dụng chỉ thị RM3412 (A), RM10711 (B), RM10793 (C), AP3206 (D) và RM10694 (E). Làn gel 1: AS996, Làn gel 2: FL478.
Tổng số 371 cá thể đã được phân tích với các chỉ thị định vị trên vùng gel
Saltol. Phát hiện 94 cá thể mang gen đích được phân tích tái tổ hợp. Sàng lọc các
A
B
C
D
thể BC3F1(AS996/FL478/AS996/AS996/AS996) sử dụng chỉ thị RM3412, RM10711, RM10793, AP3206, và RM10694 trên hình 3.13. Phân tích ADN các cá thể tái tổ hợp mang gen đích với 63 chỉ thị phân tử SSR. Số liệu về kiểu gen của 14 cá thể được đưa vào phân tích bằng phần mền GGT2.0, đã xác định cá thể P284- 112-291 của quần thể BC3F1 là tốt nhất trong 5 cá thể tái tổ hợp P284-112-291, P307-305- 21, P284-112-195, P284-112-198, P284-112-213 mang nhiều nền di truyền cây nhận gen, cả 5 cây này đã được chọn cho quá trình chọn giống SALTOL- AS996 ở các thế hệ sau.
Sơ đồ nền gen của cá thể P284-112-291 thể hiện trên hình 3.14.: Tại các locut nằm ở vị trí của gen Saltol, cây P284-112-291 có băng màu xanh nhạt, thể hiện là mang locut dị hợp tử. Đối với các locut cịn lại trên các NST, cây P284-112- 291 đều có các locut màu đỏ, thể hiện băng của locut cây nhận gen hay là nền gen của giống AS996. Như vậy, với 63 chỉ thị rải rác trên 12 nhiễm sắc thể của lúa, đã xác định được cây mang gen đích và mang tới 100% nền gen cây nhận gen. Ngồi
Hình 17 Bản đồ của cây BC3F1 - P284-112-291 phân tích bằng phần
ra các dịng mang nền gen của giống nhận gen cao như P307-305- 21, P284-112- 195, P284-112-198, P284-112-213 cũng được giữ lại để chọn dòng và phát triển trong chọn giống. Những dòng này đã được thu hạt, đánh giá tính chống chịu mặn và một số chỉ tiêu nông sinh học và các yếu tố cấu thành năng suất để chọn ra những dòng triển vọng năng suất cao và có tính chịu mặn tốt.
3.3.4. Kết quả đánh giá tính chịu mặn các dịng chọn lọc
Thí nghiệm đánh giá tính chịu mặn ở thế hệ BC3F2, BC3F3 đã được tiến hành tại Viện Di truyền Nông nghiệp theo như đã mô tả ở phần “2.3.4. Phương pháp đánh giá mặn nhân tạo”. Các dòng được đánh giá mặn tại nồng độ muối bằng EC=12dSm, tương đương mức nhiễm mặn NaCl = 60/00. Các dòng BC3F2 tham gia thí nghiệm đều có mức độ kháng tương đương giống FL478 mang vùng gen Saltol. Các dòng này được đưa ra ruộng gieo trồng để theo dõi đánh giá và thu hạt cho lần thí nghiệm tiếp theo.
Ở thế hệ BC3F3, các dòng chọn lọc được đưa vào đánh giá tính chịu mặn.
Hình 18 là hình ảnh các dịng lúa chọn lọc BC3F3có mang gen kháng được gieo trong khay và nuôi bằng môi trường dinh dưỡng Yoshida trước khi được thanh lọc mặn. Sau khi bổ sung muối vào mơi trường, có thể ghi nhận triệu chứng về mặt hình thái của các dịng/giống. Đối với FL478, sau khi bổ sung muối thì dấu hiệu đầu tiên là hiện tượng cháy đầu lá nhưng mức độ ít nghiêm trọng hơn so với giống IR29, và sau đó là hiện tượng quăn đầu lá và 1-2 lá già nhất ở một số cây có hiện tượng chết. Trong quá trình thanh lọc, các cây chịu mặn phát triển bình thường. Những cây nhiễm mặn bị héo quăn lá và phát triển chậm (giống IR29).
Hình 19. Đánh giá tính chịu mặn của các dịng BC3F3 ở nồng độ muối EC=12dSm
(NaCl=60/00 ). Trên mỗi khay thử: hàng 1: FL478; hang 10: IR29; Các hàng 2-9: Các dịng BC3F3 mang vùng gen Saltol
Hình 20: Kết thúc thí nghiệm thử mặn các dịng BC3F3 ở nồng độ muối
EC=12dSm (NaCl=60/00). Trên mỗi khay thử: hàng 1: AS996; hàng 2: FL478; hàng 10: IR29; Các hàng 3-9: Các dịng BC3F3 mang vùng gen Saltol
Ở hình 3.17, sau 14 ngày thanh lọc mặn, có sự khác biệt rõ ràng giữa giống bố mẹ: giống gốc AS996 nhiễm mặn bị héo quắt, cây chết và giống FL478 vẫn sinh trưởng tốt. Giống chuẩn nhiễm IR29 chết hết. Các dòng chọn ra từ dòng B291 cho phản ứng chống chịu tốt với mặn. Kết quả đánh giá ở bảng 2 cho thấy, mức chống chịu mặn của các dòng cho thấy dịng BC3F3 có mức chống chịu cao tương đương giống cho gen FL478. Chỉ có dịng B291-1-9 ở mức nhiễm vừa. Kết quả đánh giá được ghi nhận lại ở bảng 3.2
Bảng 9. Kết quả đánh giá mức chịu mặn của các dòng BC3F3 (AS996xFL478) theo tiêu chuẩn IRRI, 1997
STT Dòng Điểm Mức chống chịu 1 B291-1-1 3 KC 2 B291-1-2 3 KC 3 B291-1-3 3 KC 4 B291-1-4 3 KC 5 B291-1-5 3 KC 6 B291-1-6 3 KC 7 B291-1-7 3 KC 8 B291-1-8 3 KC 9 B291-1-9 5 NV 10 B291-1-10 3 KC 11 B291-1-11 3 KV 12 B291-1-12 3 KC 13 FL478 (ĐC kháng) 3 KC 14 AS996 7 N 15 IR29 (ĐC nhiễm) 7 N
Kết quả đánh giá mức chống chịu mặn của các dịng cho thấy dịng BC3F3 có mức chống chịu cao tương đương giống cho gen FL478. Chỉ có dịng B291-1-9 ở mức nhiễm vừa.
3.3.5. Đánh giá chỉ tiêu nông sinh học và yếu tố cấu thành năng suất của các dòng chịu mặn
Các dòng lúa chọn lọc được gieo trồng trên ruộng để đánh giá các đặc tính nơng sinh học: thời gian sinh trưởng, chiều cao cây, số bchiều dài lá đòng, chiều dài
cổ bông và các yếu tố cấu thành năng suất như số khóm/bơng, số hạt/bơng, tỉ lệ số hạt chắc/bơng; khối lượng 1000 hạt, năng suất.
Các số liệu được ghi nhận lại và tiến hành theo phương pháp hệ thống đánh giá chuẩn của IRRI. Số liệu được phân tích và xử lý bằng chương trình tính Excel và IRRISTART 5.0.
Bảng 10. Đặc tính nơng sinh học của các dòng AS996-Saltol (Vụ Xuân 2013) tại Hà nội
TT Tên dòng TGST (ngày) Chiều cao cây(cm) Chiều dài lá địng (cm) Chiều dài cổ bơng(cm) Chiều dài bông(cm) 1 B291-1 125 88,2±4,7 34,4±2,7 3,6 ± 1,4 23,6±0,9 2 B291-2 125 83,4±3,6 23,2±2,7 7,2±1,2 20,4±0,8 3 B291-13 125 81,0±3,0 25,1±2,6 7,0±1,4 21,9±1,4 4 B291-2-5 125 86,0±1,6 22,5±3,5 5,3±0,6 19,1±0,6 5 B291-1-10 125 99,6±2 26,1±2,5 4,7±0,4 25,8±1,4 6 B291-1-3 125 98,9±1,7 28,5±4,8 7,7±2,8 24,1±1,5 7 B291-2-2 125 104±3,1 31,2±2,6 6,2±1,6 24,1±1,3 8 B291-2-8 125 89,3±2,2 22±3,6 8,0±1,3 19,8±0,8 9 B291-2-7 125 96,3±2,3 27,1±4,8 5,8±1,9 22,5±0,6 10 B291-1-1 128 87,3±3,1 23,1±3,7 5,2±1,4 23,6±1,0 11 B291-2-15 125 89,8±5,0 22,7±3,2 3,6±0,9 20,3±1,6 12 B291-2-1 125 87,8±3,3 25,8±3,1 6,3±1,8 23,5±1,5 13 B291-2-3 125 85,8±1,7 23,2±3,9 5,5±2,2 20,1±0,9 14 B291-16 125 88,5±1,2 23,3±4,0 4,3±1,1 21,5±1,5 15 B291-1-9 130 92,7±1,5 26,2±2,1 5,2±1,3 23,8±0,9
16 B291-2-10 125 84,6±0,8 24,4±3,3 5,3±1,3 20,3±0,7 17 B291-14 125 85,4±1,1 26,7±3,3 5,1±1,1 20,8±0,9 18 B291-1-3 125 104,2±1,0 26,0±2,5 4,0±0,8 24,0±1,1 19 AS996 125 91,0±0,8 28,6±0,7 5,9±0,6 22±0,8 20 FL478 132 87,3±2,2 33,1±4,8 3,6±1,1 21±0,7
Bảng 11. Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất cúa các dòng AS996 – Saltol (Vụ Xuân 2013) tại Hà nội
TT Tên dịng bơng/khóm Số Số hạt/ bơng lép(%) Tỉ lệ P1000 hạt(g) NSLT tạ/ha (tạ/ha) NSTT
1 B291-1 5,1 ± 0,7 147,2±36,1 3,27 27,03 88,20 53,37 2 B291-2 5,5±0,5 148,7±20,1 19,3 28,30 84,22 61,0 3 B291-13 5,4±0,5 144,8±23,4 25,3 26,60 70,01 58,0 4 B291-2-5 4,8±0,5 154,7±24,9 20,9 27,54 72,93 64,2 5 B291-1-10 5,0±0,7 171,1±34,4 18,16 25,50 64,23 51,13 6 B291-1-3 4,8±0,8 172,2±49,5 3,5 26,80 96,08 65,71 7 B291-2-2 5,8±0,9 155,7±51,5 4,2 24,28 94,09 63,26 8 B291-2-8 5,1±0,8 111,0±26,8 20,9 29,65 65,53 48,17 9 B291-2-7 4,0±0,9 129,2±60,6 1,9 26,13 59,52 43,12 10 B291-1-1 4,6±0,9 144,6±40,2 2,9 28,05 81,75 59,43 11 B291-2-15 4,3±0,5 133,3±20,7 23,2 27,30 53,95 40,21 12 B291-2-1 4,3±0,5 144,2±15,1 14,5 26,98 64,27 47,31 13 B291-2-3 4,5±0,5 160,2±25,4 25,1 29,00 69,61 49,23 14 B291-16 4±0,4 118,2±30,4 8,7 29,10 56,43 42,81 15 B291-1-9 4,1±0,7 154±35,3 15,9 29,98 71,63 66,32
16 B291-2-10 4,3±0,5 160,3±29 19,2 28,50 71,29 66,00 17 B291-14 4,4±0,8 110,7±30,4 13,5 28,40 53,99 40,62 18 B291-1-3 4,9±0,8 123,9±21,6 6,4 30,78 78,77 67,20 19 AS996 4,7±0,6 145,2±21,9 23,6 26,60 62,32 51,30 20 FL478 4,6±0,5 140,7±24 9,0 28,63 75,50 60,45 CV% 1,50 LSD0,5 2,22
Kết quả ở bảng 3.4, 3.5 cho thấy thời gian sinh trưởng của các dòng biến động từ 125 ngày đến 132 ngày trong vụ xuân 2013. Chiều cao cây thay đổi từ 81,0 đến 104 cm. Chiều dài bông thay đổi từ 19,1 đến 25,8 cm. Số bơng/khóm thay đổi từ 4,1 đến 5,8 bơng/khóm. Số hạt/bơng biến động từ 110,7 đến 193,3 hạt/bông. Tỉ lệ lép biến động từ 2,5% đến 25,94%. Năng suất thực tế của các giống tham gia thí nghiệm nói chung là khá, trong khoảng 40,21 đến 67,2 tạ/ha.Trong đó, các dịng có năng suất cao như B291-1-3, B291-1-9, B291-2-10, B291-2-2, B291-1-3a, B291-2- 5 sẽ được tiếp tục đánh giá tính chịu mặn và phát triển dịng chọn giống ở thế hệ tiếp theo.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận
Sàng lọc đa hình giống cho gen và nhận gen đã được tiến hành trên 500 chỉ thị SSR, trong đó đã được xác định 63 chỉ thị. Kết quả này cho thấy tỉ lệ đa hinh ADN của hai giống AS996/FL478 là rất thấp khi sử dụng các chỉ thị phân tử SSR.
Hai cá thể của thế hệ BC1F1 là P284 và P307, có hàm lượng nền gen cây nhận cao nhất từ 89.06 đến 86.36% tương ứng, cao hơn so với chọn giống MAS và chọn giống truyền thống 16-19%. Hai cá thể này đã được sử dụng cho việc thiết lập thế hệ BC2F1.
Trong thế hệ BC2F1, ba các thể có hàm lượng hệ gen giống nhận gen là đến 93,18 đến 94,03 % đã được xác định bằng cách sàng lọc ADN và đã được sử dụng cho việc thiết lập quần thể BC3F1