CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số
ADN lúa được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp CTAB cải tiến (Shagai – Maroof - 1984) [26]. Lá lúa sau khi cấy 2 - 3 tuần được nghiền trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn. Mẫu được cho vào eppendorf 2ml và thêm 1ml đệm chiết (100mM Tris; 500mM NaCl; 50mM EDTA; 0,07% - Mercaptol ethanol) sau đó thêm 50l SDS 10% rồi ủ trong 30 phút ở 650C. Hỗn hợp trên mang ly tâm ở 13500 vòng/phút trong 20 phút, sau đó lấy dịch nổi rồi thêm 1ml isopropanol alcohol, để vào tủ 40C 30 phút, ly tâm tiếp ở 13500 vòng/phút trong 25 phút. Đổ hết dịch nổi, thêm 400l đệm TE (10mM Tris; 0,5 mM EDTA pH=8,0) rồi ủ trong 5 phút ở 65oC. Cho 3l RNAse (10mg/ml) vào mỗi ống và ủ ở 37oC 60 phút. Thêm 400l đệm CTAB (0,2M Tris HCl (pH 8,0): 2M NaCl: 0,05M EDTA (pH 8,0): 2%
CTAB, đặt vào nhiệt độ 650C trong 15 phút. Thêm vào 800l chloroform/isoamyl alcohol (24:1) sau đó ly tâm ở 13500 vòng/phút trong 10 phút. Dịch nổi được tách riêng, thêm 2,5 lần thể tích ethanol 96% và giữ trong -200C 60 phút. Ly tâm 13500 vòng/phút trong 30 phút. Thu tủa, rửa tiếp bằng 400l cồn 70%, ly tâm 13500 vòng/phút trong 5 phút. Hòa tan tủa trong TE và giữ trong -20oC để sử dụng cho các bước nghiên cứu tiếp theo.
2.3.1.2. Phương pháp PCR [5] với mồi SSR
Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR được chuẩn bị trong tấm PCR plate 96 giếng. Thành phần, hàm lượng của các chất trong mỗi phản ứng như trong bảng 4.
Bảng 4. Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR
TT Thành phần Thể tích (l)
1 H2O cất khử trùng 8.95
2 Buffer 10X 1,5
3 MgCl2 (50mM) 0,45
TT Thành phần Thể tích (l)
4 dNTP (1mM) 1,0
5 Taq ADN polymeraza (5U) 0,1
6 Mồi xuôi (5M) 0,5
7 Mồi ngược (5M) 0,5
8 ADN (35ng/ l) 2,0
Tổng thể tích: 15
Sau khi đã có đủ thành phần, hàm lượng các chất cần thiết, tiến hành đặt chương trình chạy cho máy. Chu trình nhiệt trong máy PCR như sau:
Bảng 5. Điều kiện của phản ứng PCR
Bước Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ
1 94 5 phút 1
2
94 30 giây
35
55* 30 giây
72 45 giây
3 72 5 phút 1
4 10 ∞ 1
(*): Nhiệt độ gắn mồi - có thể thay đổi tùy theo từng cặp mồi SSR cụ thể 2.3.1.3. Phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%
Các bước tiến hành
0.8g agarose hòa vào 100ml TBE 0,5X (5,4g Tris base; 2,76g axít boric; 2ml 0,5M EDTA, pH = 8,0). Đun nóng đến khi tạo thành một dung dịch đồng nhất. Để nguội đến khoảng 50 - 600C, thêm 5l ethidium bromide (10 mg/ml) và lắc đều.
Chuẩn bị khay và lược. Đổ dung dịch agarose vào khay sao cho không có bọt khí.
ngập mặt gel. Tra sản phẩm PCR đã được trộn với Xylen cyanol vào giếng. tỷ lệ 5l Xylen cyanol /15l mẫu. Thời gian và điện thế sử dụng để điện di phụ thuộc vào kích thước của cặp mồi SSR cần kiểm tra. Các mẫu chạy với ladder 25 bp. Soi gel trên máy soi cực tím, đo ̣c và ghi nhâ ̣n kết quả.
2.3.1.4. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide biến tính
Lau kỹ bề mặt hai tấm kính rồi lắp ghép lại với nhau, sử dụng nẹp Sigma 0,4mm. Đổ 60ml dung dịch 4,5% acrylamide (25,2 Urea: 6ml TBE 10X: 6,75ml acrylamide/bis-acrylamide 40% (19:1) vào cốc đong. Thêm 300l 10% APS (ammonium persulfate) và 60l TEMED (N,N,N’,N’-Tetraethyl - ethylendiamine), trộn đều. Bơm dung dịch gel vào giữa hai tấm kính sao cho không có bọt khí. Cài lược vào giữa hai tấm kính rồi dùng kẹp cố định lược. Để gel polyme hóa trong 1 - 2 giờ.
Sau khi tháo lược, thực hiện lắp ráp bộ điện di, cho 1 lít đệm TBE 1X vào buồng đệm trên và dưới. Chạy tiền điện di (prerun) với cường độ dòng điện là 50 - 60A, công suất 92 - 100W. Biến tính các sản phẩm PCR ở 950C trong 5 phút, rồi trộn với 4l Sequencing Stop solution (10mM NaOH: 95% formamid: 0,05% bromphenol;
0,05% xylene cyanol), làm lạnh nhanh trong 5 phút. 5l sản phẩm PCR được tra vào các giếng, các mẫu chạy với ladder 50 bp. Tiến hành điện di với công suất 60W và ở 500C, thời gian chạy ngắn hay dài tùy kích thước từng mồi sử dụng.
Phương pháp nhuộm bạc
Sau khi chạy điện đi, tháo gỡ tấm kính bám gel và tiến hành cố định gel. Đặt tấm kính vào khay sao cho mặt bám gel hướng lên trên, đổ dung dịch cố định/dừng phản ứng (glacial acetic 10%), để trong khoảng 30 phút. Sau đó lấy gel ra khỏi dung dịch.
Rửa gel bằng nước cất rồi cho vào dung dịch nhuộm (1g bạc nitrat (AgNO3) trong 1 lít nước cất, bổ sung thêm 1,5ml formaldehyd (H2CO) 37%.), lắc nhẹ trong 30 phút.
Gel sau đó được lấy ra rửa sạch bằng nước cất rồi đưa vào dung dịch hiện (Hòa tan 30g natri cacbonat (Na2CO3) trong 1 lít nước cất) lắc nhẹ đến khi băng xuất hiện.
Cho gel vào dung dịch cố định/dừng phản ứng trong 3 - 6 phút rửa lạivbằng nước
Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide không biến tính
Lau kỹ 2 tấm kính sau đó đặt tấm kính ngắn lên trên tấm kính dài sao cho không bị hở và dùng kẹp kẹp chặt hai tấm kính với nhau. Chuẩn bị dung dịch 6%
acrylamide, thêm các thành phần 50l TEMED và 250l APS 20%, 2,5ml TBE 10X, 7,5ml 40% acrylamide, 39,44 ml H2O, khuấy đều. Đổ từ một góc cho đến khi gel đầy tấm kính ngắn, cài lược sao cho để răng lược hướng vào trong. Sau 15 phút gel đông lại, lắp vào bể điện di sao cho không để lại bọt khí dưới tấm kính, thêm đệm TBE 0,5x ngập mặt gel khoảng 0,5cm. Rút lược ra và tra khoảng 7l mẫu cho mỗi giếng. các mẫu chạy với marker chuẩn 25bp. Điện di từ 1,5 – 5h ở 100V tùy từng kích thước cặp mồi PCR và tùy từng nồng độ gel.
Sau khi điện di xong, tháo kính, lấy gel ra cho vào một hộp kín có chứa TBE 0,5X. Cho dung dịch nhuộm Syber Safe ngâm trong 30 phút. Sau đó chụp ảnh bằng máy soi UV.